6. Đóng góp của đề tài
2.2.1.3. Bảo quản chủng giống
a. Bảo quản trên thạch nghiêng
Các khuấn lạc sau khi phân lập và cấy chuyến sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 30°c. Sau đó giữ trong tủ lạnh 4°c dùng cho nghiên cứu tiếp theo, cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [10], [12].
b. Bảo quản trong dung dịch glycerin 15%
Chủng vi khuấn được nuôi cấy trong môi trường dịch long ở 30°c sau 48 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy trong 20 phút ở 3000 vòng/ phút, tách lấy phần sinh khối. Hoà đều sinh khối trong lml dung dịch glycerin 15% vô trùng giữ ở -80°c trong các ống eppendoí vô trùng. Bảo quản theo phương pháp này cho phép giữ giống trong vòng 1 đến 3 năm [9].
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hóa giong
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuấn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121°c trong 20 phút. Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [12], [13].
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase
Nhỏ một giọt H202 3% lên bề mặt khuấn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuấn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +). Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -) [2], [5],
[8].
2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá rượu etylic thành acid acetic
30
Cao nấm men: lOg Rượu êtylic: 10%-15% (vol/vol)
Nước máy : lOOOml pH: 6,8-7.0
Xanh Bromophenol (BPB) 0,04%: 20ml
Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5ml), khử trùng ở 121°c trong 20 phút, để nguội khoảng 30°c cấy vi khuấn nghiên cứu mới hoạt hoá, nuôi 7 ngày trong điều kiện thích hợp. Quan sát thấy môi trường chuyến sang màu vàng là dương tính, không đôi màu là âm tính.
Pha dung dịch BPB 0,04%: cân 0,lg BPB nghiền nhở trong cốc sứ, sau đó bổ sung 14,9 ml NaOH 0,00 IN hoà tan cho đều. Đổ tất cả vào bình định mức thêm nước cho đến khi thế tích đạt 250ml [2].
2.2.23. Phát hiện khả năng oxy hoả acid acetic
Sử dụng môi trường sau đế thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn.
Thành phần (g/1): Cao nấm men : lOg Canxi acetat: ĩOg
Thạch : 20g Nước máy: lOOOml
pH : 7,0-7,2
Quan sát hiện tưọng nếu xung quanh khuấn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dương tính, ngược lại là âm tính [2], [6], [9].
2.2.2.4. Phát hiện khả năng chuyên hóa glycerol thành dihydroxyacetone
Đe phát hiện khả năng hình thành dihydroxyacetone từ glycerol. Chúng tôi tiến hành trên môi trường bao gồm thành phần sau:
Glycerol: 4% (g/1) CaCƠ3: 0,3% (g/1)
Cao nấm men: 0,3 % (g/1) (NH4)2S04: 0,1 % (g/1)
Cao ngô: 3% (g/1) H20: 1 OOOml pH = 5,3
Hấp thanh trùng 121°c trong 10 phút. Để môi trường nguội cấy giống vi khuấn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 30°c trong vòng 48h.
1 2 3 Độ trong và màu sắc
5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, mầu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm
4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, mầu đặc trưng cho sản phẩm.
3 Chất lỏng trong, có tương đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm.
2
Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô
trầm trọng, màu khác
nhiều so với màu đặc trưng của sản phẩm. 1
Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ
nhỏ trầm trọng, thô, màu
không đặc trưng cho sản phẩm. 0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng
Mùi
5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm. 4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm nhưng hơi khó
nhận thấy.
3 Hơi nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trưng cho sản phẩm 2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm 1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm 0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.
Vị
5 Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm 4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trưng cho sản phẩm bình
thường.
3 Chưa hòa hợp, hơi gắt và xốc, hậu yếu, ít đặc trưng cho sản phẩm. 2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm 0 Có vị lạ khó chịu của sản phẩm bị hỏng số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng 1 Độ trong và màu sắc 0,8 2 Mùi 1,2 3 Vị 2,0 Tổng cộng 4,0 S ố t h Mức chấtlượng Số điểm
chung Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chưa có trọng lượng của hội đồng cảm quan 1 Loại tốt 18,6-20,0 Mùi : 4,8 Vị: 4,8 2 Loại khá 15,2-18,5 Mùi : 3,8 Vị: 3,8 3 Loại trung bình 11,2-15,1 Mỗi chỉ tiêu : 2,8
4 Loại kém 7,2-11,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,8
5 Loại rất kém "ế o I K Mỗi chỉ tiêu : 1,0 6 Loại hỏng
0
1
co
co
Mỗi chỉ tiêu nhỏ hơn 1,0
Nhỏ dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone (có sự xuất
hiện kết tủa Cu20 màu đỏ gạch).
2.22.5.Sinh trưởng trên môi trường Hoyer
Thành phần môi trường: (g/1)
(NH4)2S04: lg KH2P04 : 0,9g
FeCl3.6H20: 0,02g MgS04.7H20: 0,25g
K2HP04 : 0,lg Rượu êtylic 99,5%: 20ml
Hấp thanh trùng 121°c trong 15 phút. Để môi trường nguội bổ sung giống nghiên cứu nuôi ở nhiệt độ khoảng 30°c trong 0, 12, 24, 48 giờ sau đó đếm số lượng tế bào trên buồng đếm.
2.22.6. Phát hiện khả năng tông hợp cellulose
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thế ở nhiệt độ 28 - 30°c trong vòng 3-4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhở lên đó dung dịch lugol và H2S04 60% nó chuyến hoá thành màu xanh lam
2.22.7. Phương pháp xác định khả năng tông họp acid băng chuân độ với NaOH 0, IN có phenolphtaleỉn 0,1% làm chỉ thị
Cho vào cốc thủy tinh (loại 100 ml hoặc 200 ml) dịch lên men, thêm vào đó 1 - 2 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Chú ý chuấn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyến sang màu hồng nhạt. Sau đó tính số gam acid tông số trong 100 ml dung dịch lên men theo công thức:
V. K .100
Trong đó: X : số gam acid tông số trong 100 ml dung dịch lên men
V : Sô ml NaOH 0,1N dùng đê chuân độ 10 ml dung dịch lên men K : Lượng acid tống số tưong ứng với 1 ml NaOH 0,1N {K =
0,006)
10 : Số ml dịch lên men đem chuẩn độ [6], [9]
2.2.3. Phương pháp cảm quan
Phân tích cảm quan thực phẩm là kỹ thuật sử dụng cơ quan cảm giác của con người đế tìm hiểu mô tả và định lượng các tính chất cảm quan vốn có của thực phấm như: màu sắc, mùi vị... Cảm quan của kombucha được đánh giá trên một số chỉ tiêu theo TCVN 3215 -79 [14]: số điểm chưa có trọng lượng là số điểm cho tưong ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗi chỉ tiêu chất lượng và được quy định trong bảng 2.1, hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu được quy định trong bảng 2.2, đánh giá mức chất lượng sản phấm ở bảng 2.3.
Bảng 2.1. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha Bảng 2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu
2.2.4. Phương pháp toán học
Xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phương pháp trong cuốn “Thống kê và ứng dụng” [1 ] như:
* Số trung bình cộng: Dùng đế tính giá trị trung bình của các lần lặp lại
thí nghiệm. X = — y X.
n
* Trung bình bình phương các sai lêch ỏ = 11—--- 11 n — 1 * Sai số đại diện của trung bình cộng ±m = ~^=
4n , , _ổx\00 * Hộ số biến thỉcn trung bình cộng: ~ A n: số lần lặp lại thí nghiệm 34 CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập các chủng vi khuấn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên
Bước 1: Nguyên liệu sử dụng là trà Thái Nguyên và đường để sản xuất kombucha. Trước hết cần đun sôi lOOOml nước, bố sung 20g trà Thái Nguyên đế trong thời gian 10-15 phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đố vào bình thủy tinh sạch, thêm lOOg đường khuấy đều, đế nguội. Sau khoảng 7 ngày ở 30°c ta thu được kombucha, bao gồm dịch trà đường lên men và miếng thạch nổi lên trên bề mặt.
Dùng vải sạch lọc lấy dịch, tiến hành phân lập vi khuấn trên môi trường 1 theo phương pháp của Vinogradski (phương pháp 2.2.1.1.1). Ket quả phân lập được 20 mẫu (ký hiệu lần lượt là Ai, A2, ..., A2o).
Môi trường 1 dùng để phân lập vi khuấn được acid hoá bằng acid acetic cũng góp phần ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật khác. Tuy nhiên có rất nhiều chủng vi khuấn có thế sống trong môi trường có độ pH thấp.
Bước 2: Nhuộm Gram 20 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn được (phương
pháp 2.2.1.1.2), kết quả cho thấy khi quan sát trên kính hiển vi quang học tất
cả các mẫu vi khuẩn đều bắt màu hồng với thuốc nhuộm. Điều này chứng tỏ rằng các mẫu vi khuấn đã tuyến chọn được đều là Gram âm. Các chủng vi khuấn có khả năng lên men kombucha thuộc rất nhiều nhóm khác nhau, bao gồm cả nhóm vi khuấn Gram dương( vi khuấn lactic) và nhóm vi khuấn Gram âm( vi khuẩn Acetobacter). Vì các mẫu vi khuẩn phân lập được đều là vi khuấn Gram âm, chính vì vậy chúng tôi quyết định tuyến chọn các mẫu vi khuấn Acetobacter có khả năng lên men kombucha phục vụ cho mục đích nghiên cúu của đề tài. Bước tiếp theo chúng tôi tiến hành sơ tuyến bằng cách
Hình 3.1. Anh mẫu vi khuấn AỊ5 nhuộm Gram Bước 3: Từ 20 mẫu vi khuấn đã chọn được ở bước 2 tiếp tục tiến hành tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter theo phương pháp của Carr (1968) [24]
(phương pháp 2.2.2.2).
Hình 3.2. Chuyến hoá ethanol thành acid acetic của các mẫu vi khuấn
Theo Bergey (1992) [16] vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacterỉaceae gồm 2 chi là Acetobacter và Gỉuconobacter. Cả hai chi đều có khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic. Acid acetic làm môi trường có chứa Blue Bromophenol 0.04% chuyến tù’ màu xanh lục sang màu vàng (hình 3.1). Các chủng thuộc chi Acetobacter có khả năng phân giải tiếp tục acid acetic thành C02 và H20 phục hồi màu xanh của môi trường. Ngược lại, các chủng thuộc chi Gỉuconobacter không có khả năng phân giải acid acetic nên môi trường vẫn giữ màu vàng.
Hầu hết các mẫu vi khuấn đã phân lập được đều có khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic (hình 3.2). Khả năng này mạnh yếu khác nhau tuỳ
36
chủng. Hon nữa các chủng đã phân lập được gồm 2 nhóm có tốc độ sinh trưởng khác nhau (nhóm sinh trưởng nhanh và nhóm sinh trưởng chậm) do đó việc theo dồi khả năng phục hồi màu xanh của môi trường đế phân biệt 2 chi
Acetobacter và Gỉuconobacter rất khó khăn, thiếu chính xác. Vì thế, sau bước
3 lựa chọn các chủng làm môi trường chuyển màu vàng và tiếp tục khảo sát khả năng oxy hoá acetate nhằm phân biệt các chủng thuộc 2 chi Acetobacter và Gluconobacter. Ket quả thu được 11 mẫu là: A], A2, A3, A5, A6, A7, Ag,
Ai3, A)5, Ai8, Ai9
Bước 4: Với 11 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn được chúng tôi tiếp tục
xác định khả năng tạo thành acid bằng cách cấy trên môi trường thạch đĩa (môi trưòng l)có bố sung thêm CaC03 7g/l (phương pháp 2.2.23). Các mẫu vi khuấn có khả năng sinh acid, acid này phân giải CaCƠ3 trong môi trưòng do đó xung quanh khuấn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt. Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuấn lạc trên môi trường có chứa CaC03 điều đó cho thây acid đã được tạo thành. Chúng tham gia phản ứng với CaC03 đê chuyên môi trường từ màu trắng sang không màu theo phương trình:
H+ + CaC03 -> Ca2+ + H20 + C02
Theo Bergey (1992) [16], cả 2 chi Acetobacter và Glucobacter đều có khả năng oxy hoá lactate nhưng chỉ có các vi khuấn thuộc chi Acetobacter mới có khả năng oxy hoá acetate. Vì thế, trong môi trường có chứa calcium acetate, các chủng vi khuấn thuộc chi Acetobacter có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cácbon hay nói cách khác chúng có khả năng oxy hoá acid acetic thành C02 và H20; giải phóng ATP. Ket quả này cũng phù họp với nghiên cúu của Hai-Peng Cheng và cs (2002) [25] khi xác định sự có mặt của acid gĩuconic trong tổng họp cellulose. Kết quả thu được 9 mẫu là: Ai, A2, A3, A6, A8, Ai3, Ai5, A]8, A19.
Từ các kết quả trên cho thấy, 9 mẫu vi khuấn đã tuyến chọn được là các vi khuấn thuộc giống Acetobacter.
Hình 3.3. Khả năng oxy hoá acetateBước 5: Kiếm tra hoạt tính catalase (phươngpháp 2.2.2.1) thu được kết Bước 5: Kiếm tra hoạt tính catalase (phươngpháp 2.2.2.1) thu được kết quả là cả 9 mẫu vi khuẩn đều có phản ứng catalase dương tính.
Khi nhỏ H202 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí (hình 3.3). Chứng tỏ oxy được giải phóng ra, hay nói cách khác dưới tác dụng của enzyme catalase phân giải H202 theo phương trình:
H2o2—> H 2 O
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter Bước 6: Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone
(phươngpháp 2.2.2.4).
Vi khuấn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 30°c trong vòng 48h. Nhở dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone. Ket quả cả 9 mẫu vi khuấn đều thấy xuất hiện kết tủa Cu20 màu đỏ gạch.
38
Bước 7ĩ Khả năng sinh sắc tố nâu
Khi nuôi cấy 9 mẫu vi khuấn đã tuyến chọn trên môi trường thạch và dịch thể, không thấy hình thành sắc tố nâu, điều đó chứng tỏ rằng những chủng vi khuấn Acetobacter không hình thành sản phấm 2,5-dixeto gluconic acid và 7- propyonic cho nên dịch nuôi cấy không màu. Ket quả: 9 mẫu vi khuấn đều không thấy hình thành sắc tố nâu.
Bước 8: Sinh trưởng trên môi trường Hoyer (phương pháp 2.2.2.5).
Khi nuôi cấy vi khuấn Acetobacter trên môi trường Hoyer theo dõi bằng cách lấy dịch nuôi cấy đếm số lượng tế bào vi khuấn trên buồng đếm cho thấy số lượng 6 mẫu vi khuấn không tăng. Môi trường Hoyer là môi trường chỉ bao gồm các nhân tố khoáng, 6 mẫu vi khuẩn Acetobacter sử dụng muối (NH4)2S04 như là nguồn nitơ và rượu êtylic như là nguồn cacbon đế duy trì sự tồn tại của tế bào, mà không tăng sinh khối tế bào.
Điều này có thế giải thích như sau: Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung [2] và Nguyễn Thành Đạt [10] 6 mẫu Acetobacter này thuộc nhóm vi sinh vật khuyết dường, điều kiện cho chúng sinh trưởng tăng sinh khối khi môi trường nuôi cấy được bố sung các chất kích thích sinh trưởng (acid folic, các loại vitamin B5, B6, B12...). Ket quả thí nghiệm cho thấy 6 mẫu vi khuẩn không có khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer là: Ai, A2, A3, A6, A15, A19.
Bước 9: Khả năng tổng hợp cellulose (phương pháp 2.2.2.6).
Quan sát sự tạo thành màng ta thấy:
Nhóm /: Tạo thành màng nhầy nhẵn, không được nâng lên theo thành
bình (gồm các mẫu vi khuấn: A8, A]3).
Nhóm 2: Tạo màng nhẵn dai, được nâng lên theo thành bình ( gồm các
3 A3 30,01+0,021 0,037 0,123 4 A6 27,93+0,020 0,035 0,118 5 As 25,01+0,027 0,046 0,128 6 A,3 31,13+0,017 0,03 0,096 7 AIS 33,00+0,040 0,069 0,209 8 A]8 32,13+0,000 0,000 0,000 9 A]9 29,92+0,021 0,037 0,124 ST T Chỉ tiêu đánh giá Chủng Ai A 2 A 3 Aô A8 Ai3 Ai5 Ai8 Al9 1 Độ trong và màu sắc 2,8 3,6 1, 3,4 2,0 3,6 3,6 3,2 3,6 2 Mùi 4,2 5,6 2, 3,6 2,9 4,8 5,6 4,9 4,8 3 Vị 6, 0 9,4 5, 6,8 05, 8,2 9,4 6,2 7,4 4 Tổng điểm 13 ,0 18, 9, 13, 99, 16, 18, 14, 15,
Nhóm 3: Tạo màng khô và nhăn nheo, được nâng lên theo thành bình
(gồm các mẫu vi khuấn: A2, A]9).
Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng của 9 mẫu vi khuấn, trong đó có 4 mẫu màng vi khuấn của nhóm 2 xuất hiện màu lam. Do màng của vi khuấn nhóm 2 tạo thành có bản chất là cellulose nên màng này sẽ bắt màu xanh với iốt (hình 3.5).
Hình 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulose của vi khuẩn Acetobacter nhóm 2
Từ 20 mâu vi khuân phân lập được, tuyến chọn sơ bộ được 9 mâu vỉ