6. Đóng góp của đề tài
2.2.1.3. Bảo quản chủng giống
a. Bảo quản trên thạch nghiêng
Các khuấn lạc sau khi phân lập và cấy chuyến sang môi trường giữ
giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 30°c. Sau đó giữ trong tủ
lạnh 4°c dùng cho nghiên cứu tiếp theo, cấy chuyền giữ giống trên thạch
nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [10], [12].
b. Bảo quản trong dung dịch glycerin 15%
Chủng vi khuấn được nuôi cấy trong môi trường dịch long ở 30°c sau
48 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy trong 20 phút ở 3000 vòng/ phút, tách lấy
phần sinh khối. Hoà đều sinh khối trong lml dung dịch glycerin 15% vô trùng
giữ ở -80°c trong các ống eppendoí vô trùng. Bảo quản theo phương pháp
này cho phép giữ giống trong vòng 1 đến 3 năm [9].
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hóa giong
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử
dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật
cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu
chuấn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121°c trong 20 phút. Sau
đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng
vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [12], [13].
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase
Nhỏ một giọt H202 3% lên bề mặt khuấn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi
bọt khí thì chủng vi khuấn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +).
Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -) [2], [5],
[8].
2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá rượu etylic thành acid acetic
30
Cao nấm men: lOg Rượu êtylic: 10%-15% (vol/vol)
Nước máy : lOOOml pH: 6,8-7.0
Xanh Bromophenol (BPB) 0,04%: 20ml
Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5ml), khử trùng ở 121°c trong
20 phút, để nguội khoảng 30°c cấy vi khuấn nghiên cứu mới hoạt hoá, nuôi 7
ngày trong điều kiện thích hợp. Quan sát thấy môi trường chuyến sang màu
vàng là dương tính, không đôi màu là âm tính.
Pha dung dịch BPB 0,04%: cân 0,lg BPB nghiền nhở trong cốc sứ, sau
đó bổ sung 14,9 ml NaOH 0,00 IN hoà tan cho đều. Đổ tất cả vào bình định
mức thêm nước cho đến khi thế tích đạt 250ml [2].
2.2.23. Phát hiện khả năng oxy hoả acid acetic
Sử dụng môi trường sau đế thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi
khuẩn tuyển chọn.
Thành phần (g/1): Cao nấm men : lOg Canxi acetat: ĩOg
Thạch : 20g Nước máy: lOOOml
pH : 7,0-7,2
Quan sát hiện tưọng nếu xung quanh khuấn lạc có vòng phân giải canxi
là phản ứng dương tính, ngược lại là âm tính [2], [6], [9].
2.2.2.4. Phát hiện khả năng chuyên hóa glycerol thành dihydroxyacetone
Đe phát hiện khả năng hình thành dihydroxyacetone từ glycerol. Chúng
tôi tiến hành trên môi trường bao gồm thành phần sau:
Glycerol: 4% (g/1) CaCƠ3: 0,3% (g/1)
Cao nấm men: 0,3 % (g/1) (NH4)2S04: 0,1 % (g/1)
Cao ngô: 3% (g/1) H20: 1 OOOml pH = 5,3
Hấp thanh trùng 121°c trong 10 phút. Để môi trường nguội cấy giống
vi khuấn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 30°c trong vòng 48h.
1 2 3
Độ
trong
và
màu
sắc
5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, mầu hoàn toàn đặc
trưng cho sản phẩm
4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, mầu đặc trưng
cho sản phẩm.
3 Chất lỏng trong, có tương đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi khác một ít so
với màu đặc trưng của sản phẩm.
2
Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô
trầm trọng, màu khác
nhiều so với màu đặc trưng của sản phẩm.
1
Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ
nhỏ trầm trọng, thô, màu
không đặc trưng cho sản phẩm.
0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng
Mùi
5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm nhưng hơi khó
nhận thấy.
3 Hơi nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trưng cho sản phẩm
2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm
1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm
0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.
Vị
5 Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm
4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trưng cho sản phẩm bình
thường.
3 Chưa hòa hợp, hơi gắt và xốc, hậu yếu, ít đặc trưng cho sản phẩm.
2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm
0 Có vị lạ khó chịu của sản phẩm bị hỏng
số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng
1 Độ trong và màu sắc 0,8
2 Mùi 1,2
3 Vị 2,0
Tổng cộng 4,0
S
ố
t
h Mức chấtlượng
Số điểm
chung Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chưa có trọng
lượng của hội đồng cảm quan
1 Loại tốt
18,6-20,0 Mùi : 4,8
Vị: 4,8
2 Loại khá
15,2-18,5 Mùi : 3,8
Vị: 3,8
3 Loại trung bình 11,2-15,1 Mỗi chỉ tiêu : 2,8
4 Loại kém 7,2-11,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,8
5 Loại rất kém "ế o I K Mỗi chỉ tiêu : 1,0
6 Loại hỏng
0
1
co
co
Mỗi chỉ tiêu nhỏ hơn 1,0
Nhỏ dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone (có sự xuất
hiện kết tủa Cu20 màu đỏ gạch).
2.22.5.Sinh trưởng trên môi trường Hoyer
Thành phần môi trường: (g/1)
(NH4)2S04: lg KH2P04 : 0,9g
FeCl3.6H20: 0,02g MgS04.7H20: 0,25g
K2HP04 : 0,lg Rượu êtylic 99,5%: 20ml
Hấp thanh trùng 121°c trong 15 phút. Để môi trường nguội bổ sung
giống nghiên cứu nuôi ở nhiệt độ khoảng 30°c trong 0, 12, 24, 48 giờ sau đó
đếm số lượng tế bào trên buồng đếm.
2.22.6. Phát hiện khả năng tông hợp cellulose
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thế ở nhiệt độ 28 - 30°c trong
vòng 3-4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt màu của
màng bằng cách nhở lên đó dung dịch lugol và H2S04 60% nó chuyến hoá
thành màu xanh lam
2.22.7. Phương pháp xác định khả năng tông họp acid băng chuân độ với
NaOH 0, IN có phenolphtaleỉn 0,1% làm chỉ thị
Cho vào cốc thủy tinh (loại 100 ml hoặc 200 ml) dịch lên men, thêm
vào đó 1 - 2 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N.
Chú ý chuấn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyến sang màu hồng
nhạt. Sau đó tính số gam acid tông số trong 100 ml dung dịch lên men theo
công thức:
V. K .100
Trong đó: X : số gam acid tông số trong 100 ml dung dịch lên men
V : Sô ml NaOH 0,1N dùng đê chuân độ 10 ml dung dịch lên men
K : Lượng acid tống số tưong ứng với 1 ml NaOH 0,1N {K =
0,006)
10 : Số ml dịch lên men đem chuẩn độ [6], [9]
2.2.3. Phương pháp cảm quan
Phân tích cảm quan thực phẩm là kỹ thuật sử dụng cơ quan cảm giác của
con người đế tìm hiểu mô tả và định lượng các tính chất cảm quan vốn có của
thực phấm như: màu sắc, mùi vị... Cảm quan của kombucha được đánh giá trên
một số chỉ tiêu theo TCVN 3215 -79 [14]: số điểm chưa có trọng lượng là số
điểm cho tưong ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗi chỉ tiêu chất lượng và
được quy định trong bảng 2.1, hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu được quy
định trong bảng 2.2, đánh giá mức chất lượng sản phấm ở bảng 2.3.
Bảng 2.1. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha
Bảng 2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu
2.2.4. Phương pháp toán học
Xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phương pháp
trong cuốn “Thống kê và ứng dụng” [1 ] như:
* Số trung bình cộng: Dùng đế tính giá trị trung bình của các lần lặp lại
thí nghiệm. X = — y X.
n
* Trung bình bình phương các sai lêch ỏ = 11—---
11 n — 1
* Sai số đại diện của trung bình cộng ±m = ~^=
4n
, , _ổx\00
* Hộ số biến thỉcn trung bình cộng: ~
A
n: số lần lặp lại thí nghiệm
34
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập các chủng vi khuấn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên
Bước 1: Nguyên liệu sử dụng là trà Thái Nguyên và đường để sản xuất
kombucha. Trước hết cần đun sôi lOOOml nước, bố sung 20g trà Thái Nguyên
đế trong thời gian 10-15 phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đố vào bình thủy tinh
sạch, thêm lOOg đường khuấy đều, đế nguội. Sau khoảng 7 ngày ở 30°c ta thu
được kombucha, bao gồm dịch trà đường lên men và miếng thạch nổi lên trên
bề mặt.
Dùng vải sạch lọc lấy dịch, tiến hành phân lập vi khuấn trên môi trường
1 theo phương pháp của Vinogradski (phương pháp 2.2.1.1.1). Ket quả phân
lập được 20 mẫu (ký hiệu lần lượt là Ai, A2, ..., A2o).
Môi trường 1 dùng để phân lập vi khuấn được acid hoá bằng acid acetic
cũng góp phần ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật khác. Tuy nhiên
có rất nhiều chủng vi khuấn có thế sống trong môi trường có độ pH thấp.
Bước 2: Nhuộm Gram 20 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn được (phương
pháp 2.2.1.1.2), kết quả cho thấy khi quan sát trên kính hiển vi quang học tất
cả các mẫu vi khuẩn đều bắt màu hồng với thuốc nhuộm. Điều này chứng tỏ
rằng các mẫu vi khuấn đã tuyến chọn được đều là Gram âm. Các chủng vi
khuấn có khả năng lên men kombucha thuộc rất nhiều nhóm khác nhau, bao
gồm cả nhóm vi khuấn Gram dương( vi khuấn lactic) và nhóm vi khuấn Gram
âm( vi khuẩn Acetobacter). Vì các mẫu vi khuẩn phân lập được đều là vi
khuấn Gram âm, chính vì vậy chúng tôi quyết định tuyến chọn các mẫu vi
khuấn Acetobacter có khả năng lên men kombucha phục vụ cho mục đích
nghiên cúu của đề tài. Bước tiếp theo chúng tôi tiến hành sơ tuyến bằng cách
Hình 3.1. Anh mẫu vi khuấn AỊ5 nhuộm Gram
Bước 3: Từ 20 mẫu vi khuấn đã chọn được ở bước 2 tiếp tục tiến hành
tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter theo phương pháp của Carr (1968) [24]
(phương pháp 2.2.2.2).
Hình 3.2. Chuyến hoá ethanol thành acid acetic của các mẫu vi khuấn
Theo Bergey (1992) [16] vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacterỉaceae
gồm 2 chi là Acetobacter và Gỉuconobacter. Cả hai chi đều có khả năng oxy
hoá ethanol thành acid acetic. Acid acetic làm môi trường có chứa Blue
Bromophenol 0.04% chuyến tù’ màu xanh lục sang màu vàng (hình 3.1). Các
chủng thuộc chi Acetobacter có khả năng phân giải tiếp tục acid acetic thành
C02 và H20 phục hồi màu xanh của môi trường. Ngược lại, các chủng thuộc
chi Gỉuconobacter không có khả năng phân giải acid acetic nên môi trường
vẫn giữ màu vàng.
Hầu hết các mẫu vi khuấn đã phân lập được đều có khả năng oxy hoá
ethanol thành acid acetic (hình 3.2). Khả năng này mạnh yếu khác nhau tuỳ
36
chủng. Hon nữa các chủng đã phân lập được gồm 2 nhóm có tốc độ sinh
trưởng khác nhau (nhóm sinh trưởng nhanh và nhóm sinh trưởng chậm) do đó
việc theo dồi khả năng phục hồi màu xanh của môi trường đế phân biệt 2 chi
Acetobacter và Gỉuconobacter rất khó khăn, thiếu chính xác. Vì thế, sau bước
3 lựa chọn các chủng làm môi trường chuyển màu vàng và tiếp tục khảo sát
khả năng oxy hoá acetate nhằm phân biệt các chủng thuộc 2 chi Acetobacter
và Gluconobacter. Ket quả thu được 11 mẫu là: A], A2, A3, A5, A6, A7, Ag,
Ai3, A)5, Ai8, Ai9
Bước 4: Với 11 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn được chúng tôi tiếp tục
xác định khả năng tạo thành acid bằng cách cấy trên môi trường thạch đĩa
(môi trưòng l)có bố sung thêm CaC03 7g/l (phương pháp 2.2.23). Các mẫu
vi khuấn có khả năng sinh acid, acid này phân giải CaCƠ3 trong môi trưòng
do đó xung quanh khuấn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt. Vòng sáng
xuất hiện xung quanh khuấn lạc trên môi trường có chứa CaC03 điều đó cho
thây acid đã được tạo thành. Chúng tham gia phản ứng với CaC03 đê chuyên
môi trường từ màu trắng sang không màu theo phương trình:
H+ + CaC03 -> Ca2+ + H20 + C02
Theo Bergey (1992) [16], cả 2 chi Acetobacter và Glucobacter đều có
khả năng oxy hoá lactate nhưng chỉ có các vi khuấn thuộc chi Acetobacter
mới có khả năng oxy hoá acetate. Vì thế, trong môi trường có chứa calcium
acetate, các chủng vi khuấn thuộc chi Acetobacter có khả năng sử dụng
muối acetate làm nguồn cácbon hay nói cách khác chúng có khả năng oxy
hoá acid acetic thành C02 và H20; giải phóng ATP. Ket quả này cũng phù
họp với nghiên cúu của Hai-Peng Cheng và cs (2002) [25] khi xác định sự có
mặt của acid gĩuconic trong tổng họp cellulose. Kết quả thu được 9 mẫu là: Ai,
A2, A3, A6, A8, Ai3, Ai5, A]8, A19.
Từ các kết quả trên cho thấy, 9 mẫu vi khuấn đã tuyến chọn được là các
vi khuấn thuộc giống Acetobacter.
Hình 3.3. Khả năng oxy hoá acetateBước 5: Kiếm tra hoạt tính catalase (phươngpháp 2.2.2.1) thu được kết
Bước 5: Kiếm tra hoạt tính catalase (phươngpháp 2.2.2.1) thu được kết
quả là cả 9 mẫu vi khuẩn đều có phản ứng catalase dương tính.
Khi nhỏ H202 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí (hình
3.3). Chứng tỏ oxy được giải phóng ra, hay nói cách khác dưới tác dụng của
enzyme catalase phân giải H202 theo phương trình:
H2o2—> H 2 O
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter
Bước 6: Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone
(phươngpháp 2.2.2.4).
Vi khuấn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 30°c trong
vòng 48h. Nhở dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone.
Ket quả cả 9 mẫu vi khuấn đều thấy xuất hiện kết tủa Cu20 màu đỏ gạch.
38
Bước 7ĩ Khả năng sinh sắc tố nâu
Khi nuôi cấy 9 mẫu vi khuấn đã tuyến chọn trên môi trường thạch và
dịch thể, không thấy hình thành sắc tố nâu, điều đó chứng tỏ rằng những
chủng vi khuấn Acetobacter không hình thành sản phấm 2,5-dixeto gluconic
acid và 7- propyonic cho nên dịch nuôi cấy không màu. Ket quả: 9 mẫu vi
khuấn đều không thấy hình thành sắc tố nâu.
Bước 8: Sinh trưởng trên môi trường Hoyer (phương pháp 2.2.2.5).
Khi nuôi cấy vi khuấn Acetobacter trên môi trường Hoyer theo dõi
bằng cách lấy dịch nuôi cấy đếm số lượng tế bào vi khuấn trên buồng đếm
cho thấy số lượng 6 mẫu vi khuấn không tăng. Môi trường Hoyer là môi
trường chỉ bao gồm các nhân tố khoáng, 6 mẫu vi khuẩn Acetobacter sử dụng
muối (NH4)2S04 như là nguồn nitơ và rượu êtylic như là nguồn cacbon đế duy
trì sự tồn tại của tế bào, mà không tăng sinh khối tế bào.
Điều này có thế giải thích như sau: Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung
[2] và Nguyễn Thành Đạt [10] 6 mẫu Acetobacter này thuộc nhóm vi sinh vật
khuyết dường, điều kiện cho chúng sinh trưởng tăng sinh khối khi môi trường
nuôi cấy được bố sung các chất kích thích sinh trưởng (acid folic, các loại
vitamin B5, B6, B12...). Ket quả thí nghiệm cho thấy 6 mẫu vi khuẩn không
có khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer là: Ai, A2, A3, A6, A15, A19.
Bước 9: Khả năng tổng hợp cellulose (phương pháp 2.2.2.6).
Quan sát sự tạo thành màng ta thấy:
Nhóm /: Tạo thành màng nhầy nhẵn, không được nâng lên theo thành
bình (gồm các mẫu vi khuấn: A8, A]3).
Nhóm 2: Tạo màng nhẵn dai, được nâng lên theo thành bình ( gồm các
3 A3 30,01+0,021 0,037 0,123
4 A6 27,93+0,020 0,035 0,118
5 As 25,01+0,027 0,046 0,128
6 A,3 31,13+0,017 0,03 0,096
7 AIS 33,00+0,040 0,069 0,209
8 A]8 32,13+0,000 0,000 0,000
9 A]9 29,92+0,021 0,037 0,124
ST
T
Chỉ tiêu đánh
giá Chủng
Ai A
2
A
3 Aô A8 Ai3 Ai5 Ai8 Al9
1 Độ trong và màu sắc 2,8 3,6 1, 3,4 2,0 3,6 3,6 3,2 3,6
2 Mùi 4,2 5,6 2, 3,6 2,9 4,8 5,6 4,9 4,8
3 Vị 6,
0 9,4 5, 6,8 05, 8,2 9,4 6,2 7,4
4 Tổng điểm 13
,0 18, 9, 13, 99, 16, 18, 14, 15,
Nhóm 3: Tạo màng khô và nhăn nheo, được nâng lên theo thành bình
(gồm các mẫu vi khuấn: A2, A]9).
Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng của 9 mẫu vi
khuấn, trong đó có 4 mẫu màng vi khuấn của nhóm 2 xuất hiện màu lam. Do
màng của vi khuấn nhóm 2 tạo thành có bản chất là cellulose nên màng này sẽ
bắt màu xanh với iốt (hình 3.5).
Hình 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulose của vi khuẩn Acetobacter nhóm 2
Từ 20 mâu vi khuân phân lập được, tuyến chọn sơ bộ được 9 mâu vỉ
Một phần của tài liệu
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LÊN MEN KOMBUCHA TỪ TRÀ THÁI NGUYÊN
(Trang 37 -37 )
