- Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: những bệnh nhân được chẩn đoá nu nguyên bào thần kinh đệm.
2.5.2. Tách chiết DNA
Mẫu mô sau khi loại bỏ paraphin tiến hành tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol. Quy trình tách chiết tiến hành qua các bước: Loại bỏ paraffin => Phá vỡ màng tế bào và màng nhân => Loại bỏ protein => Tủa DNA => Rửa tủa => Hòa tan DNA.
Loại bỏ paraffin:
− Cho 1ml toluen hoặc xylen để loại bỏ paraffin.
− Lắc, votex 20-30 giây.
− Ly tâm tốc độ 15000 vòng/5 phút, ở nhiệt độ phòng.
− Hút bỏ xylen cho 1ml cồn tuyệt đối => votex 20-30 giây
− Ly tâm 15000 vòng/ 5 phút.
− Hút bỏ cồn, để khô ở 56 độ C Phá vỡ màng tế bào và màng nhân:
− Cho thêm 650µl dung dịch Lysis buffer HD và 5µl proteinase K.
− Vortex mạnh cho tan tủa rồi đem ủ ở 56oC cho đến khi tủa tan hết. Loại bỏ tạp chất và tủa DNA:
− Sau khi ủ cho tủa tan hết, cho thêm 500µl dung dịch PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1).
− Trộn đều => Ly tâm 15000vòng/phút trong 10 phút ở 4oC.
− Sau khi ly tâm, hỗn hợp phân thành 3 lớp: Lớp trên cùng có chứa DNA, lớp giữa là cặn tế bào và protein, lớp dưới cùng là dịch chiết. Thu lớp trên trong suốt ra một ống eppendorf 1,5ml sạch đã được đánh dấu sẵn.
− Cho thêm 500µl dung dịch CI (Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1).
− Trộn đều => Ly tâm 15000vòng/phút trong 10 phút ở 4oC.
DNA ra một ống eppendorf mới. Tủa và thu DNA:
− Cho thêm 2,5V ethanol 100% và 0,1V Sodium acetate (CH3COONa).
− Lắc đều, quan sát tủa.
− Để ở -20oC trong 2-3h cho DNA kết tủa hoàn toàn.
− Sau 2-3h, đem ly tâm 15000vòng/phút trong 15 phút ở 4oC => Loại bỏ dịch nổi, thu tủa.
− Cho thêm 1ml ethanol 70% để rửa tủa.
− Trộn đều => Ly tâm 15000vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.
− Thu tủa DNA, để khô ở 56oC cho đến khi khô hẳn (thường hơn 30 phút).
− Cho thêm 50-60µl nước tinh khiết hoặc TE để hòa tan DNA.
