- Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: những bệnh nhân được chẩn đoá nu nguyên bào thần kinh đệm.
Chương 4 BÀN LUẬN
4.2. Kết quả khuếch đại gen PCR
Kết quả PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: chất lượng và nồng độ DNA mẫu, nồng độ và thiết kế mồi, hệ thống đệm, chu trình nhiệt. Bất kỳ yếu tố nào cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR cuối cùng.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng GoldTaq, trong thành phần của nó đã bao gồm TaqDNA polymerase, một hệ thống dung dịch đệm với pH thích hợp, đã chứa ion Mg2+ và các dNTP với nồng độ phù hợp. Các yếu tố trước tiên ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR là nồng độ và độ tinh sạch của DNA mẫu, chu tình nhiệt và thiết kế mồi. Chất lượng DNA được tách chiết đã được đảm bảo về cả nồng độ và độ tinh sạch cho phản ứng PCR (Bảng 3.1). Mồi đã được thiết kế đạt yêu cầu về chiều dài, số lượng tương đương các nucleotide, trình tự các nucleotide…và đã được sử dụng thành
công ở các lần trươc đó. Do vậy, để có sản phẩm PCR mong muốn, trước tiên phải chuẩn hóa chu trình nhiệt cho PCR.
Nhiệt độ biến tính của DNA khuôn có thể do động trong khoảng 90-98ºC. Nếu nhiệt độ này cao quá và ké dài sẽ làm giảm cả số lượng cũng như chất lượng của Taq DNA polymerase vì thời gian bán hủy của Taq không dài: 2h/92,5ºC, 40 phút/ 95ºC, 5 phút/ 97,5ºC [23 ].Trong chuẩn hóa chu trình nhiệt thì việc chuẩn hóa nhiệt độ và thời gian gắn mồi là đặc biệt quan trọng vì nó ảnh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Nhiệt độ gắn mồi được xác định dựa vào nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm). Tm là nhiệt độ mà ở đó một nửa số lượng mồi được gắn với gen đích tại vị trí đặc hiệu [24]. Sau khi thử nghiệm chúng tôi thấy nhiệt độ gắn mồi là 55ºC trong 30 giây cho kết quả cao nhất. Tất cả các mẫu đều được khuếch đại trên máy PCR với chu trình nhiệt: biến tính ở 95oC trong 5 phút, sau đó thực hiện 35 chu kỳ gồm: biến tính ở 95oC trong 30 giây, gắn mồi ở 55oC trong 30 giây, kéo dài ở 72oC trong 1 phút; và tiếp tục kéo dài ở 72oC trong 5 phút nữa; cuối cùng giữ ở 15oC. Chu trình nhiệt này đã được chứng minh hiệu quả ở tất cả các mẫu khuếch đại.
Sau khi tối ưu hóa tất cả các quá trình cho phản ứng PCR. Sản phẩm DNA được khuếch đại tiến hành kiểm tra bằng điện di tren gel agarose 1,5%. Kết quả sản phẩm PCR đạt hiệu quả, sản phẩm thu được đặc hiệu, tuy nhiên xuất hiện hai mẫu G5, G7 cho kết quả dương tính (+) ở mồi F12 nhưng âm tính (-) ở mồi F13. Để xác định nguyên nhân do đột biến xảy ra trên đoạn gen khuếch đại hay xảy ra tại vị trí gắn mồi và những đột biến này có liên quan đến bệnh glioblastoma không, cần các nghiên cứu sâu hơn để có thể xác định được mối tương quan giữa gen và bệnh.