- Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: những bệnh nhân được chẩn đoá nu nguyên bào thần kinh đệm.
2.5.4. Khuếch đại đoạn gen FGFR bằng phương pháp PCR
DNA sau khi được tách chiết và kiểm tra độ tinh sạch, độ tinh sạch đạt yêu cầu được dử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại đoạn gen có chứa đột biến gen FGFR1 và dung hợp gen FGFR3-TACC3 bằng máy PCR Eppendorf. Tất cả các mẫu DNA sau khi được tách chiết đều được pha loãng về nồng độ 50-100 ng/µl để thực hiện phản ứng PCR.
Chuẩn bị PCR master mix:
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nước cất 2 lần 3
2 Gold taq 2X 5
3 Mồi xuôi (10pmol/µl) 0,5
4 Mồi ngược (10pmol/µl) 0,5
5 DNA 1
Tổng thể tích 10
Chu trình nhiệt của phản ứng:
Biến tính hoàn toàn: 95 ºC trong 5 phút Biến tính: 95 ºC trong 30 giây
Gắn mồi: 55 ºC trong 30 giây x 35 chu kỳ Kéo dài: 72 ºC trong 1 phút
Kéo dài hoàn toàn: 72 ºC trong 5 phút Bảo quản:15C
Đoạn gen FGFR1 tại vị trí exon 12 và exon 13 được khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu.
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose:
Chuẩn bị gel agarose 1,5%:
− Chuẩn bị trước khay điện di, lược tạo giếng.
− Cho 25ml dung dịch đệm TBE 1X (pha từ dung dịch TBE 10X) vào lọ thủy tinh sạch. Cân 0,375g agarose rồi cho vào lọ thủy tinh đã chuẩn bị.
− Đun nóng hỗn hợp trong lò vi sóng đến khi agarose tan hết tạo thành một dung dịch trong suốt.
− Đợi nhiệt độ của thạch về khoảng 60oC rồi đổ vào khay điện di đã cắm sẵn lược.
− Để khoảng 60 phút cho đến khi gel đông hoàn toàn.
− Để bản gel ngâm chìm trong bể điện di đã có sẵn dung dịch đệm TBE, chú ý đặt bản gel một cách ngay ngắn.
Chuẩn bị mẫu điện di:
− Tra 5µl sản phẩm PCR vào các giếng trên bản gel. − Tra 3µl Marker loại 100bp vào giếng số 1.
Chạy điện di: Tiến hành chạy điện di các mẫu DNA cùng với Marker ở hiệu điện thế 120 V trong 35 phút.
Nhuộm bản gel điện di và chụp ảnh:
− Ngâm bản gel điện di vào dung dịch Ethydium bromide trong 5 phút. − Rửa bản gel bằng nước để loại bỏ thuốc nhuộm còn dư và cặn bẩn.
− Bản gel sau khi nhuộm được soi bằng đèn tử ngoại (UV). Quan sát các băng sản phẩm PCR xuất hiện trên bản gel sau đó chụp ảnh lạị.