- Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: những bệnh nhân được chẩn đoá nu nguyên bào thần kinh đệm.
Chương 4 BÀN LUẬN
4.3. Giải trình tự xác định đột biến gen FGFR
Kỹ thuật giải trình tự gen giúp xác định trình tự các nucleotide trên phân tử DNA, từ đó có thể phát hiện được những thay đổi có khả năng dẫn đến thay đổi bệnh lý. Giải trình tự gen được thực hiện trên máy ABI-3100. Để có kết quả được rõ đẹp nhằm xác định chính xác đột biến, cần thông qua nhiều giai đoạn:
- Khuếch đại riêng biệt các exon 12, exon 13 trên gen FGFR1, điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm PCR. Sau phản ứng khuếch đại, nếu chất lượng DNA không tốt, bị đứt gãy, tạp nhiễm thì băng điện di sẽ bị mờ, không đều hoặc xuất hiện các băng phụ [23],[25]. Từ kết quả điện di trên hình 3.5 cho thấy kêt quả điện di trên gel agarose xuất hiện những băng sáng, bờ đều, sắc gọn, không có băng phụ. Kết quả này cho thấy sản phẩm khuếch đại trên gen FGFR là đáng tin cậy để tiến hành các quy trình giải trình tự gen. Đồng thời kết quả của giai đoạn này góp phần khẳng định sự tối ưu hóa của các giai đoạn tách chiết và tinh sạch DNA trước đó.
- Giải trình gen FGFR bằng Bigdye kit và tinh sạch sản phẩm sau phản ứng: Sau khi khuếch đại và kiểm tra độ tinh sạch của gen FGFR trên exon 12 và exon 13 đạt tiêu chuẩn tốt, chúng tôi tiến hành phản ứng giải trình tự gen theo Bigdye kit. Để có thể tiến hành phân tích kết quả trên máy đọc giải trình tự xác định được đột biến thì sau khi chạy phản ứng giải trình tự, sản phẩm mong muốn cần được tinh sạch khỏi những dNTP dư thừa. Do các dNTP có khả năng phát quang nên có thê che lấp các tin hiệu trình tự ở giai đoạn đầu của quá trình đọc trình tự và có thể gây nhiêu tín hiệu. Do đó, tinh sạch sản phẩm sau sử dụng Bigdye kit là công đoạn không thẻ thiếu để tạo ra sản phẩm thuần nhất trước khi tiến hành kỹ thuật giải trình tự gen. Chúng tôi sử dung cồn 70º để tich sạch và thu được sản phẩm tinh khiết.
- Kết quả giải trình tự gen: Sử dụng máy giải trình tự gen tự động và trình tự gen của các mẫu nghiên cứu được đối chiếu với trình tự GenBank trên
ngân hàng gen thế giới và được phân tích để xác định vùng hoặc điểm đột biến. Nếu sản phẩm giải trình tự không được tinh sạch tốt sẽ tạo ra các tín hiệu gây nhiễu, gây khó khăn trong việc xác định đột biến và loại đột biến. Các kết quả giải trình tự gen trên exon 12 và exon 13 của gen FGFR1 (hình 3.5) cho thấy hình ảnh các đỉnh của tín hiệu rõ ràng và hầu như không có các tín hiệu nhiễu, là minh chứng cho sự tối ưu cac giai đoạn của quy trình kỹ thuật trước đó. Đọc kết quả giải trình tự cho thấy tại vị trí exon 12 và exon 13 trên gen FGFR1 không xuất hiện đột biến. Do số lượng cỡ mẫu nhỏ và hiện Việt Nam chưa có nghiên cứu nào tương ứng nên số liệu không có ý nghĩa thống kê. Kết quả chỉ mang tính bước đầu xác định một số đột biến gen FGFR trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.
Trên thế giới đã có những nghiên cứu sâu và rộng hơn về đột biến FGFR cũng như ảnh hưởng của đột biến này trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.
Vikki Rand, Jiaqi Hungang, Jim Stockwell và cộng sự đã tiến hành thực hiện nghiên cứu khuếch đại 161 exon trên 20 vùng tyrosine kinase của 20 bệnh nhân glioblastoma ở Mỹ năm 2005. Phân tích sự biểu hiện của gen FGFR1 phát hiện một đột biến điểm tại exon 12 và một đột biến điểm tại exon 13. Đây là nghiên cứu đầu tiên về xác định đột biến gen trên vùng tyrosine kinase của gen FGFR1 có liên quan đến ung thư[20]. Do tỷ lệ bệnh glioblastoma gặp ở chủng tộc người da trắng nhiều hơn các chủng tộc khác nên tỷ lệ đột biến ở mỹ cao hơn so với nưới ta. Ngoài ra theo nghiên cứu của Devendre Singh, Joseph Minhow Chan, Pietro Zoppoli và cộng sự năm 2012 trên 97 bệnh nhân glioblastoma, cho thấy đột biến dung hợp gen FGFR- TACC chiếm tỷ lệ 3,1%. Từ các nghiên cứu trên cho thấy có mối tương quan chặt chẽ giữa đột biến gen FGFR, dung hợp gen FGFR-TACC trên bệnh nhân
glioblastoma, mở ra một phương pháp điều trị đích mới với hy vọng kéo dài thời gian sống cho những bệnh nhân này.
Do đột biến gen FGFR gặp với tỷ lệ thấp và được nghiên cứu trên cỡ mẫu nhỏ do đó chúng tôi chưa phát hiện đột biến gen FGFR trong nghiên cứu. Cần có những nghiên cứu sâu và rộng hơn với cỡ mẫu lớn hơn để có thể biết được chính xác tỷ lệ đột biến, cũng như có thể so sánh với kết quả trên thế giới.
1. Đã hoàn thành quy trình xác định đột biến gen FGFR treenmaaux bệnh phẩm đúc paraffin.
2. Chưa phát hiện được đột biến trên exon 12, exon 13 gen FGFR ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm do cỡ mẫu nghiên cứu còn hạn chế.
khoa, Nhà xuất bản Y học,Hà Nội.
2. Wen PY, Kesari S (2008). Malignant gliomas in adults. N. Engl. J. Med, 359(5), 492-507.
3. J Pathol (2014). Using the Molecular Classification of Glioblastoma to Inform Personalized Treatment. Author manuscript, 232(2), 165-177. 4. Furnari FB, Fenton T, Bachoo RM et al (2007). Malignant astrocytic
glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes Dev, 21(21), 2683–2710.
5. Daniel D. Trương, Lê Đức Hinh, Nguyễn Thi Hùng (2004). Thần kinh học lâm sàng. Nhà xuất bản y học, Hà nội.
6. Hoàng Minh Đỗ (2009). Nghiên cứu chẩn đoán và thái độ điều trị u não thể glioma bán càu đại não. Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y
7. Wen PY, K. S (2008). Malignant gliomas in adults. N. Engl. J. Med, 359(5),492-507.
8. Roel G.W. Verhaak, Katherine A., Elizabeth P (2010). An integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of
glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR and NF1. Cancer Cell, 17(1), 98.
9. Silvani A, Gaviani P, Lamperti EA et al (2009). Cisplatinum and BCNU chemotherapy in primary glioblastoma patients. J.
Neurooncol, 94(1), 57-62.
10. Walker MD. The contemporary role of chemotherapy in the treatment of malignant brain tumor (1978). Clin. Neurosurg, 25, 388-396.
12. Agarwala SS, Kirkwood JM (2000). Temozolomide, a novel alkylating agent with activity in the central nervous system, may improve the treatment of advanced metastatic melanoma. Oncologist, 5(2), 144-151.
13. Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ et al (2005). Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med, 352(10), 987-996.
14. Monzon FA, Ogino S, Hammond EH et al (2009). The role of KRAS mutation testing in the management of patients with metastatic colorectal cancer. Arch Path Lab Med, 133, 1600-1606.
15. O’Brien C, Wallin JJ, Sampath D et al (2010). Predictive biomarkers of sensitivity to the phosphatidylinositol 3' kinase inhibitor GDC- 0941 in breast cancer preclinical models. Clin Cancer Res, 16(14), 3670-3683.
16. Dienstmann R1, Rodon J, Prat A et al (2014). Genomic aberrations in the FGFR pathway: opportunities for targeted therapies in solid tumors. Ann oncol, 25(3), 552-563.
17. Tuner N and Grose R (2010). Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Rev Cancer, 10, 116-129.
18. Singh p, Thomas GE, Gireesh KK et al (2014). TACC3 Protein Regulates Microtubule Nucleation by Affecting γ-Tubulin Ring Complexes. J Biol Chem, 289(46), 31719-31735.
19. Haugsten EM, Wiedlocha A, Olsnes S Ellen et al (2010). Roles of Fibroblast Growth Factor Receptors in Carcinogenesis. Mol Cancer Res, 10, 1158-1541.
21. Singh D, Chan JM, Zoppoli et al (2012). Transforming Fusions of FGFR and TACC Genes in Human Glioblastoma. Science, 337(6099), 1231-1235.
22. Rasmussen H.B (2012). Restriction Fragment Length Polymorphin Analysis of PCR-RFLP and Gel Electrophoresis-Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting. INTECH Open Access Publisher.
23. Tạ Thành Văn (2010). PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
24. Asano h., toyooka s., tokumo m. et al (2006). Detection of EGFR gen mutation in Lung Cancer by mutant – Enrichid Polymerase Chain Reaction Assay. Clin Cancer Res, 12, 43-48.
25. Robertson JM và Walsh-Weller J (1998) . An Introduction to PCR Primer Design and Optimization of Amplification Reactions.
Methods Mol Biol, 98, 121-154.
26. Khuất Hữu Thanh (2006). Nguyên lý kỹ thuật gen. Kỹ thuật gen – Nguyên lý và ứng dụng, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.102-53.