Hình 3.5. Quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein
Đầu tôm
Xử lý sơ bộ
Bổ sung acid lactic nồng độ 0,6%
Thu hồi hỗn hợp caroten-protein Thời gian ủ 3 giờ
Thuyết minh quy trình :
- Chuẩn bị nguyên liệu : Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng tươi được lấy tại phân xưởng chế biến. Chất lượng đầu tôm tươi, không bị biến đổi màu sắc như đên đầu hay đỏ đầu, không nhiễm rác và tạp chất, được lưu trữ lạnh bằng thùng xốp cách nhiệt (<50C) với đá khô khi đưa về phòng thí nghiệm. Phế liệu tôm trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo. Trong điều kiện chưa thí nghiệm ngay thì được bao gói bảo quản đông trong điều kiện nhiệt độ -200C.
- Cân một lượng nguyên liệu cần thiết cho một mẻ chế biến, nghiền nhỏ nguyên liệu bằng máy xay đến kích thước khoảng 2-3 mm.
- Giai đoạn thủy phân protein bằng enzyme nội tại : Bổ sung acid lactic với nồng độ 0,6%. Thời gian thủy phân trong 3 giờ.
- Ép (lọc) : Sau khi ủ xong thì ta tiến hành thu hồi dịch hỗn hợp caroten-protein, phần bã được rửa lại để đảm bảo có thể thu hồi hết hỗn hợp caroten-protein còn bám dính trong bã.
- Thu hồi hỗn hơp caroten-protein : dịch sau khi được ép được điều chỉnh pH 4,3-4,5 để tạo kết tủa caroten-protein, kết hợp nâng nhiệt dịch lọc sau khi điều chỉnh pH lên 700C trong 10 phút. Sau cùng, bổ sung 100 ppm chitosan 1% để lắng qua đêm ở 40C.
- Ly tâm 3500 vòng/phút trong 15 phút, nhiệt độ ly tâm cài đặt 250C để loại nước ra khỏi hỗn hợp bột nhão.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
- Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng phù hợp để thực hiện quá trình chiết rút caroten-protein.
- Hỗn hợp caroten-protein được thu nhận từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp ủ xi lô, điều kiện thủy phân thích hợp là bổ sung acid lactic với nồng độ 0,6% và ủ trong 3 giờ.
- Hỗn hợp caroten-protein thu hồi được có hiệu suất và hàm lượng carotenoid thích hợp cho việc ứng dụng để làm thức ăn cho cá hồi.
KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu triển khai thử nghiệm kết quả nghiên cứu ứng dụng phương pháp ủ xi lô vào trong quá trình sản xuất chitin để thu nhận hỗn hợp caroten-protein làm thức ăn cho động vật nuôi ở quy mô lớn hơn.
- Vì thời gian có hạn nên nghiên cứu chỉ dừng lại ở công đoạn thu hồi hỗn hợp caroten-protein ở dạng bột nhão. Nên cần tiếp tục hoàn thiện quy trình sản xuất thức ăn cho cá hồi từ hỗn hợp caroten-protein được chiết rút từ đầu tôm thẻ chân trắng. Tìm ra chế độ bảo quản thích hợp.
- Tiếp tục thực hiện nghiên cứu kết hợp các acid vô cơ và hữu cơ, acid và enzyme… để cải thiện nhược điểm của từng loại acid.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hoàng Thị Huệ An (2004), “Nghiên cứu chiết xuất astaxanthin từ phế liệu vỏ tôm”, Tạp chí Khoa học-Công nghệ Thủy sản, Số Đặc biệt, tr. 51-54.
2. Phạm thị Cảnh (2006), Nghiên cứu ứng dụng các biện pháp tiền xử lý để nâng cao chất lượng Chitin - Chitosan từ phế liệu tôm, Luận văn tốt nghiệp, Đại học
Thủy sản, Nha Trang.
3. GS.TSKH Phạm Thị Trân Châu, Hóa sinh học (2007), NXB Giáo dục.
4. Nguyễn Hữu Dũng (2005), Tận dụng phế liệu tôm, Dự án cải thiện chất lượng và
xuất khẩu thủy sản SEAQUID, Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội.
5. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch và Phạm Văn Ty (1976), Một sốphương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2, Nxb Khoa
học Kỹ thuật, Hà Nội.
6. Hà Văn Hùng (2006), Nghiên cứu thu hồi hỗn hợp Protein-Astaxanthin trong dịch thải của quy trình sản xuất Chitin từ phế liệu tôm, Đại học Thủy Sản, Nha
Trang.
7. Ngô Thanh Lĩnh (2009), Nghiên cứu kết hợp phương pháp ủ xi lô trong công nghệ sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu đầu tôm, Luận văn thạc sĩ kỹ thuật, Trường Đại Học Nha Trang, Nha Trang.
8. Trần Thị Luyến - Đỗ Minh Phụng - Nguyễn Anh Tuấn (2003), Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thuỷ sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
9. Nguyễn Hoàng Nhạn (2012), Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong quá trình thu hồi carotenoprotein từ phế liệu đầu tôm, Đồ án tốt nghiệp kỹ sư, Trường Đại Học Nha Trang, Nha Trang.
10. Lê Văn Nhật (2005), Nghiên cứu thu hồi và astaxanthin trong quy trình sản xuất chitin từ phê liệu tôm, Đồ án tốt nghiệp kỹ sư, Trường Đại Học Nha Trang, Nha Trang.
11. Phạm Thị Đan Phượng (2012), Nghiên cứu thu nhận bột đạm giàu carotenoid từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp xử lý kết hợp hai enzyme protease,
Luận văn thạc sĩ kỹ thuật, Trường Đại Học Nha Trang, Nha Trang.
12.Hồ Diễm Thúy ( 2013), “Xây dựng quy trình ủ chua bã sắn bằng vi khuẩn lactic thích hợp để giảm lượng cyanua tổng”, Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật, Trường Đại học
Nha Trang.
13. Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Tiến Hóa (2013), “Ảnh hưởng của thức ăn có bổ sung astaxanthin và canthaxanthin với tỷ lệ khác nhau lên màu sắc thịt cá hồi Vân (Oncorhynchus mykiss)”, Tạp chí Khoa học và Phát Triển 2013, 11(7), Tr. 981-
986.
14. Trang Sĩ Trung (2008), Nghiên cứu kết hợp phương pháp sinh học để nâng cao hiệu quả qui trình sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu đầu vỏ tôm, Báo cáo Đề tài
cấp Bộ, Trường Đại học Nha Trang, Nha Trang.
15. Trang Sỹ Trung (2010), Chitin-chitosan từ phế liệu thủy sản và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp.
16. Lương Thị Xuyến,2008, “Bước đầu nghiên cứu ép tách protein từđầu tôm thẻ trong quá trình sản xuất chitin và bổ sung protein thu hồi được vào chượp trong sản xuất nước mắm”, Đồ án tốt nghiệp đại học.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
17.Armenta, R. E. and Guerrero, I. L (2009), "Amino acid profile and enhancement of the enzymatic hydrolysis of fermented shrimp carotenoproteins", Food Chemistry,112, pp. 310-315.
18. Bower. C. K., Hietala. K. A.,2008, Acidification Methods for Stabilization and Storage of Salmon By-Product, Journal of Aquatic Food Product Technology, 17, 459-478.
19. Chen, H.M., Meyers, S.P. (1982), “Extraction of astaxanthin pigment from crawfish using a soy oil process”, J Food Sci., 47(3), pp. 892-896.
20. Higuera-Ciapara, I., Felix-Valenzuela, L. and Goycoolea, F. M. (2006), "Astaxanthin: a review of its chemistry and applications", Crit Rev Food Sci Nutr, 46, pp. 185-96. 39.
21. Hussein, G., Sankawa, U., Goto, H., Matsumoto, K., Watanabe, H. (2006), “Astaxanthin, a carotenoid with potential in human health and nutrition”, J. Nat. Prod, 69, pp. 443–449.
22. Meyers, S. P. (1994), “Developments in world aquaculture, feed formulations, and role of carotenoids”, Pure Applied Chemistry, 66, pp. 1069–1076.
23. Miki, W. (1991), "Biological functions and activities of animal carotenoids",
Pure Appl. Chem, 63, pp. 141-146.
24. Nesreen Samir Mahmoud, Abdelkader Ghaly (2006) “Unconventional dermineralization of crustacean waste for the production of chitin”.
25. Pratya Charoenvuttitham; John Shi; Gauri S. Mittal-Canada “Chitin extraction from black tiger shrimp waste using organic acids”.
26. Sachindra, N.M., Bhaskar, N., Mahendrakar, N.S. (2006), “Recovery of carotenoids from shrimp waste in organic solvents”, Waste Manag, 26, pp. 1092–
1098
27.Sowmya, R., Rathinaraj, K. và Sachindra, N. M. (2011), “An Autolytic Process
for Recovery of Antioxidant Activity Rich Carotenoprotein from Shrimp Heads”, Mar Biotechnol, 13, pp. 918–927.
28. Zagalsky, P. E. (1976), "Carotenoid-protein complexes", Pure Appl. Chem, 47,
pp. 103-120.
29. Windsor, M. & Barlow, S. 1981. Introduction to fishery byproducts, p. 84-100. Fishing News Book Ltd.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Các phương pháp phân tích chính sử dụng trong đề tài
1) Xác định hàm lượng ẩm và hàm lượng khoáng
Cốc sấy được sấy khô ở nhiệt độ 105oC trong 5-6 giờ (đến khối lượng không đổi), sau đó để trong bình hút ẩm để làm nguội. Cân xác định khối lượng của cốc sấy là W1. Cho mẫu cho vào cốc sấy cân được khối lượng W2. Sấy ở 105oC trong 24 giờ, cân được khối lượng W3 (AOAC, 1990). Tất cả khối lượng xác định đều tính theo gram. Hàm lượng ẩm tính theo công thức sau:
% Hàm lượng ẩm = [(W2 – W3)/( W2 – W1)] x 100
Sau khi xác định hàm lượng ẩm, ta đem nung cốc sấy có chứa mẫu khô ở nhiệt độ 600oC, khoảng 6 giờ, để trong bình hút ẩm và cân được khối lượng W4. Hàm lượng tro được xác định theo công thức sau:
% Hàm lượng tro = [(W4 – W1)/(W2 – W1)] x 100
2) Xác định hàm lượng khoáng tổng số bằng phương pháp nung ở nhiệt độ 500 – 6000C.
* Nguyên lý: Dùng sức nóng 600÷660C nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra % hàm lượng tro có trong nguyên liêụ.
* Tiến hành xác định: Nung chén xứ đã rửa sạch ở lò nung tới 600C đến trọng lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng cốc trên cân phân tích với độ chính xác 10-4, cho vào chén m (g) mẫu. Cân tất cả trên cân phân tích với độ chính xác như trên. Cho tất cả vào lò nung ở nhiệt độ 660C. Nung đến tro trắng nghĩa là loại hết các chất hữu cơ, thường mất 6h. Sau đó lấy ra để nguôi trong bình hút ẩm, rồi đem cân trên cân phân tích.
* Tính kết quả: X = (%) 1 100 ) 2 ( G G G G Trong đó: G: Trọng lượng cốc (g).
G1: Trọng lượng cốc + mẫu (g). G2: Trọng lượng cốc + tro (g)
3) Xác định hàm lượng astaxanthin tổng số bằng phương pháp quang phổ
Cân chính xác 1g mẫu cho vào ống đồng thể hóa (hay cốc thủy tinh). Thêm 5ml dung môi chứa hexan và isopropanol với tỷ lệ 3:2. Đồng thể hóa trong 2 phút. Để yên 30 phút. Tách chiết 3 lần. Dịch chiết được đựng trong bình chiết và bổ sung thêm nước muối sinh lý với tỷ lệ 1:2. Lắc nhẹ bình chiết và để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng cho tách pha hoàn toàn. Tách bỏ pha dưới, lấy pha hexan bên trên. Tiến hành cô quay chân không ở 40oC để bay hơi hexan. Hòa tan mẫu với ete dầu mỏ và định mức lên 10ml. Sau đó, tiến hành pha loãng mẫu (nếu cần) và đo độ hấp thụ của dung dịch ở 468 nm(A468), dùng eter dầu mỏ làm dung dịch so sánh.
Hàm lượng astaxanthin tổng số trong mẫu được tính theo công thức của Saito và Regier (1971): C (µg/g mẫu) = ) .( . 2 , 0 . . A g G V D
Trong đó: C: là hàm lượng astaxanthin (µg/g mẫu). A: độ hấp thụ của dung dịch ở 468 nm. V: thể tích pha loãng (ml).
D: hệ số pha loãng.
G: trọng lượng mẫu khô (g).
0,2: là độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 468 nm của 1 µg/ml astaxanthin chuẩn.
4) Xác định hàm lượng đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl Nguyên lý
Vô cơ hóa mẫu bằng acid sulfuric đậm đặc với sự có mặt của chất xúc tác. Sau đó, tiến hành kiềm hóa sản phẩm phản ứng. Tiếp theo, chưng cất và chuẩn độ
lượng amoniac giải phóng ra, từ đó tính được hàm lượng nitơ tổng số trong mẫu. Để tính hàm lượng protein thô, lấy giá trị hàm lượng nitơ tổng số nhân với hệ số 6,25.
Dụng cụ, hóa chất
Dụng cụ: Bộ chưng cất đạm Kjeldahl tự động, Đức. Các dụng cụ thủy tinh của bộ chưng cất đạm kèm theo và một số dụng cụ thủy tinh khác như ống đong, bình định mức, cốc... chịu nhiệt của Đức.
Hóa chất: H2SO4 đậm đặc, dung dịch NaOH 40%, hỗn hợp xúc tác K2SO4 và CuSO4 (5:1), dung dịch H3BO3 4%, thuốc thử tashiro (2g metyl xanh: 1g metyl đỏ pha trong 1000ml cồn 96o).
Tiến hành
Vô cơ hóa mẫu: Cân một lượng mẫu từ 0,2 – 1g cho vào ống Kjeldahl. Thêm khoảng 0,5-1g xúc tác (hỗn hợp K2SO4:CuSO4 theo tỉ lệ 5:1). Cho vào ống khoảng 12 ml acid sulfuric đậm đặc. Đặt các ống Kjeldahl vào hệ thống phá mẫu. Cài đặt nhiệt độ và thời gian cho máy, thời gian vô cơ hóa mẫu khoảng từ 3 – 4 giờ. Khi giai đoạn này hoàn tất, chất lỏng trong ống trong và có màu xanh da trời nhạt hoặc có màu trắng. Nếu thấy trong ống vẫn còn một số cặn rắn thì thêm ít nước cất vào rồi lắc đều.
Chưng cất amoniac: Đặt các ống Kjeldahl đã vô cơ hóa vào hệ thống chưng cất. Thời gian chưng cất một mẫu khoảng 5 phút. Thêm 2 giọt chỉ thị Tashiro vào bình hấp thụ và tiến hành chưng cất.
Chuẩn độ lượng amoniac đã hấp thụ: tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,02N. Dấu hiệu ngừng chuẩn độ là khi màu của dung dịch chuẩn độ chuyển từ màu xanh dương sang màu mận đỏ.
Tính kết quả
Hàm lượng nitơ trong mẫu thử được xác định theo công thức sau:
WN (%) =( )∗ ∗
Trong đó:
V1 : thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thử(ml). Vo: thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml) M : khối lượng mẫu đem phân tích (g).
C: Nồng độ HCl dung để chỉnh độ.
Hàm lượng protein thô trong mẫu thử được xác định theo công thức sau:
WProtein (%) = 6,25* WN
Trong đó:
WN: hàm lượng nitơ tổng số trong mẫu (%)
WProtein: hàm lượng protein thô trong mẫu (%)
4) Hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein được tính theo phương pháp của Dauphin
Cụ thể:
Hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein (%) = (M*100)/M0; M: Khối lượng hỗn hợp caroten-protein thu được (g);
M0: Khối lượng nguyên liệu (g).
5) Xác định hàm lượng lipid theo phương pháp Folch Nguyên lý:
Dùng hỗn hợp dung môi Chloroform: Methanol với tỉ lệ 2:1 để hoà tan tất cả chất béo trong mẫu, tách lớp và chiết qua phiễu lọc nhiều lần. Sau khi làm bay hơi hết dung môi, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lượng lipid trong 100g mẫu.
Dụng cụ, hóa chất và thiết bị: Dụng cụ và thiết bị:
Tủ hút, máy đồng hoá, máy cô quay chân không, tủ sấy chân không, bộ thổi khí N2.
Phễu chiết 250ml và 100ml, bình cầu 100ml, bình định mức 5ml, ống
nghiệm có nắp 5, ống thuỷ tinh Vial cao 20ml, ống thuỷ tinh có nắp 4ml, ống xilanh 20ml, giấy lọc GF/C, giá đỡ dụng cụ chiết, pipette passture.
BHT (Butylated hydroxy toluen), pha 20µl BHT trong 1ml Chloroform. Methanol 50% (CH3OH: H2O tỉ lệ 1:1) Chloroform NaCl 0,9%. Tiến hành Tách lipid từ mẫu
Cân 1g mẫu đã được trộn đều, cho vào ống thủy tinh vial cao thể tích 20ml. Cho thêm 600µl nước cất, 5ml Methanol, 10ml Chloroform và 200µl BHT. Ngâm mẫu trong dung môi khoảng 10 phút.
Đồng hoá mẫu bằng máy trong 1 phút.
Đổ vào ống xilanh có lót tấm giấy lọc GF/C ở dưới đáy cho dịch mẫu chảy xuống hết hoàn toàn.
Cho thêm 5ml Methanol và 10ml Chloroform vào vial và đồng hóa mẫu trong 20 giây.
Đổ dung dịch này vào xilanh, cho mẫu được lọc hết hoàn toàn.
Sử dụng pitton xilanh để ép tống dung dịch còn lại trong xilanh xuống phễu chiết 100ml.
Cho thêm 7,5ml NaCl 0,9% vào phễu chiết chứa dịch mẫu. Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần và giữ mẫu ở 5oC trong khoảng 4giờ để dịch mẫu phân chia thành 2 lớp.
Chiết rút dung dịch lipid
Tách lớp dưới (chứa hàm lượng lipid hoà tan trong dung môi) cho chảy vào phễu chiết thể tích 50ml. Loại bỏ lớp dịch phía trên (chứa phần hóa hợp gồm các tạp chất được loại như nước, muối, protein….).
Xác định thể tích chiết ở trên (Vdm).
Cho thêm 5ml CH3OH 50% vào mỗi mẫu trong phễu chiết 100ml. Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần.
Cho phân chia tách thành 2 lớp và lắng qua đêm ở 5oC.
Định lượng lipid
Lớp dưới được rút chảy xuống bình cầu 100ml.
Cô quay chân không làm bay hơi dung môi trong bình cầu ở 37oC đến khi còn lại thể tích khoảng 1ml.
Hòa tan mẫu lại ngay lập tức bằng một lượng thể tích nhỏ Chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc rất nhỏ lượng mẫu đã làm khô với không khí).
Chuyển nhượng mẫu qua bình định mức 5ml, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng Chloroform vừa đủ 5ml.
Sau khi xử lý xong, dung dịch này được mang đi xác định hàm lượng lipid tổng.
Dung dịch này có thể lưu giữ trong tủ đông –20oC.
Xác định hàm lượng lipid tổng
Lấy chính xác 2ml dung dịch mẫu đã xử lý, cho vào một ống thuỷ tinh có nắp 4ml đã được sấy chân không và cân với lượng không đổi.
Làm khô bằng khí nitơ.
Cho vào tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi, áp suất khoảng 65-70