Chitosan mang tính chất đặc trưng của điện tích dương nên có thể tương tác với phần lớn các chất hữu cơ mang điện tích âm. Nó thể hiện là một chất keo tụ, tạo bông tốt, có hiệu quả trong việc thu hồi các chất hữu cơ trong nước và đặc biệt là
protein. Phân tử chitosan cũng có khả năng hấp phụ, tạo cầu nối để liên kết các hạt keo protein đã kết tủa thành các phân tử có kích thước lớn hơn và lắng. Ngoài ra, chitosan còn có độ deacetyl cao thì trong dung dịch có chứa nhiều gốc amin tích điện dương sẽ trung hòa điện tích của các phân tử protein tích điện âm trong dung dịch nước rửa, giảm khả năng hydrat hóa, tập hợp lại và kết tụ [15]. Nồng độ chitosan cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả thu hồi, cần sử dụng chitosan ở một nồng độ hợp lý vì khi tăng nồng độ chitosan làm tăng số điện tích cùng dấu và đẩy nhau tạo nên một mạng lưới keo cản trở quá trình keo tụ lắng xuống của các phân tử protein. Chitosan có độ deacetyl hóa càng cao thì các nhóm tích điện dương trên mạch chitosan càng nhiều, thuận lợi trong tương tác ion để thu hồi protein hòa tan.
Ưu điểm của phương pháp này là không gây biến tính protein, không độc hại và hiệu quả thu nhận cao. Do đó phương pháp này áp dụng để tận thu các chế phẩm enzyme và các hợp chất có hoạt tính sinh học.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nguyên cứu
2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng
Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được lấy tại phân xưởng chế biến Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Chất lượng đầu tôm tươi, không bị biến đổi màu sắc như đen đầu hay đỏ đầu, không bẩn nhiễm rác và tạp chất, được lưu giữ lạnh bằng thùng xốp cách nhiệt (<50C) với đá khô khi đưa về phòng thí nghiệm. Phế liệu tôm trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo. Trong trường hợp chưa thí nghiệm ngay thì bao gói bảo quản đông trong điều kiện nhiệt độ - 200C.
Hình 2.1. Đầu tôm thẻ chân trắng
Lưu ý, chỉ sử dụng đầu tôm và không sử dụng vỏ tôm vì hàm lượng caroten- protein trong vỏ rất ít.
2.1.2.Acid HCl
Thông thường người ta dùng acid clohydric công nghiệp để thủy phân. Dùng HCl để thủy phân có ưu điểm hơn các hóa chất khác vì dịch thủy phân cho màu sắc đẹp, NH3 ít và sự tổn thất acid amin cũng ít [16].
Ở cùng điều kiện pH, nhiệt độ khi dùng H2SO4 thủy phân thì nhanh hơn HCl, giá thành cũng không đắt hơn nhiều nhưng màu sắc của dịch thủy phân xấu, có nhiều NH3 và mất đi một số acid amin như tryptophan vì H2SO4 có tính chất oxy hóa [16].
Dùng NaOH thủy phân cũng nhanh hơn HCl nhưng nó khử đi một số acid amin. Còn dùng Na2CO3 thủy phân thì chậm nhất và dung dịch thủy phân xong trung hòa tới pH=7 thì lượng acid phải tiêu tốn nhiều hơn lượng Na2CO3 đem thủy phân [16].
Vì vậy dùng HCl thủy phân là tốt hơn cả.
2.1.3. Acid lactic
Việc sử dụng các acid hữu cơ như acid lactic để bảo quản phế liệu từ nguyên liệu tươi đã được dùng trong thực phẩm bắt đầu từ rất lâu và rất phổ biến. Theo Windsor và Barlow (1981) sử dụng nguyên liệu hoặc phế liệu thủy sản để ủ xi lô là một dạng thức ăn cho động vật nuôi vừa rẻ lại vừa đơn giản [29]. Trong suốt thời gian ủ, enzyme nội tại phân giải protein sẽ phá vỡ cấu trúc tế bào phân tử protein hình thành nên các peptid, amino acid với khả năng hòa tan và ổn định trong dịch ủ.Đồng thời, acid lactic là tác nhân chính trong quá trình lên men lactic. Các chủng lactic có mặt trong sản phẩm sẽ làm thay đổi các tính chất cảm quan và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Các sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men sẽ ức chế sự hoạt động của đa số các vi sinh vật gây thối khác, do đó làm tăng tính an toàn và kéo dài thời gian bảo quản của sản phẩm.
Acid lactic đáp ứng được ưu điểm của một acid hữu cơ, đồng thời giá thành phù hợp cho việc có thể áp dụng vào trong sản xuất công nghiệp. Việc lựa chọn acid
lactic để áp dụng vào thí nghiệm nói riêng và trong sản xuất công nghiệp nói chung là điều hợp lý và cần thiết.
2.1.4.Dụng cụ, hóa chất
Các loại acid như acid clohydric, acid lactic, hexan, isopropanol, BHT, chitosan, ete dầu mỏ. Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết được dùng cho phân tích.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Thuyết minh quy trình :
Nguyên liệu đầu tôm được làm sạch, loại bỏ rác, phần ươn hỏng,bổ sung 100 ml nước, nghiền mẫu với kích thước 2-3 mm, nhằm tăng diện tích tiếp xúc trong quá trình thủy phân.
Sau đó, tiến hành thủy phân bằng cách bổ sung acid HCl hoặc acid lactic với nồng độ và thời gian xử lý thích hợp. Tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã. Phần bã được rửa bằng nước sạch, nước rửa được thu hồi cùng với phần dịch. Phần bã được đưa sang công đoạn sản xuất chitin, chitosan còn phần dịch được tiếp tục thu hồi chế phẩm caroten-protein. Xác định các yếu tố như nồng độ acid lactic, acid HCl, thời gian xử lý tối ưu của quá trình thủy phân được xác định thông qua hiệu suất thu hồi chế phẩm carotein-protein và hàm lượng carotenoid.
Quá trình thu hồi caroten-protein được thực hiện bằng phương pháp kết hợp giữa kết tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện và xử lý nhiệt, đồng thời có thể bất hoạt được enzyme để kết thúc quá trình thủy phân, ngoài ra trong quá trình này có sử dụng chitosan đóng vai trò là chất tạo tủa và keo tụ để tăng hiệu quả quá trình kết tủa protein theo nghiên cứu của Trang Sĩ Trung [15]. Cụ thể: dịch thủy phân chứa caroten-protein được điều chỉnh pH về pH 4,3-4,5 bằng HCl 10% để kết tủa protein, gia nhiệt 700C/10 phút, bổ sung chitosan ở nồng độ 100 ppm. Sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng/phút.
Hình2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Thu hồi hỗn hợp caroten-protein và đánh giá hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp.
Phân riêng Đầu tôm nguyên liệu
Xử lý sơ bộ
Xác định nồng độ acidHCl
Xác định thời gian xử lý acid lactic
Phần dịch thủy phân
Thu hồi hỗn hợp caroten-protein Phần bã
Xác định nồng độ acid lactic
Xác định thời gian xử lý acid HCl
Sản xuất chitin- chitosan
Đánh giá hiệu suất thu hồi, xác định hàm lượng astaxanthin
Đánh giá chất lượng chế phẩm thu được từ hai quy trình
Đề xuất nghiên cứu hoàn thiện quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein bằng phương pháp ủ xi lô Đề xuất quy trình ủ xi lô bằng
acid HCl
Đề xuất quy trình ủ xi lô bằng acid lactic
2.2.2. Xác định nồng độ HCl bổ sung
Hình 2.3.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid HCl
Mục đích : Xác định nồng độ HCl thích hợp để hiệu suất thu hồi cao và hàm lượng astaxanthin cao nhấ
Tiến hành thí nghiệm:
0,3%
Thời gian xử lý trong 1 giờ Đầu tôm
Xử lí sơ bộ
Xác định nồng độ acid HCl
0% 0,1% 0,2% 0,4% 0,5%
Thu hồi hỗn hợp caroten- protein
Đánh giá hiệu quả thu hồi và xác định hàm lượng astaxanthin
Đầu tôm được rửa sạch loại bỏ rác, đầu tôm ươn hỏng. Cân mỗi mẫu thí nghiệm 100g, bổ sung 95 ml nước, xay nhỏ đến kích thước khoảng 2-3mm.
Sau đó, các mẫu được bổ sung acid HCl vào mẫu với các nồng độ khác nhau : 0%, 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5%. Các mẫu được ủ trong 1 giờ trước khi tiến hành lọc ép. Tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã. Thu hồi caroten- protein từ phần dịch bằng cách kết hợp cả ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 700C/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng [15]. Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra nồng độ acid HCl thích hợp.
Chỉ tiêu đánh giá : Hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin.
Kết quả thăm dò : Chọn nồng độ HCl thích hợp để đạt hiệu quả thu hồi cao và hàm lượng astaxanthin cao nhất.
2.2.3. Xác định thời gian xử lý acid HCl
Mục đích : Xác định thời gian xử lý với HCl thích hợp để tách chiết hỗn hợp caroten-protein đạt hiệu quả cao nhất.
Tiến hành thí nghiệm:
Đầu tôm được rửa sạch loại bỏ rác, đầu tôm ươn hỏng. Cân mỗi mẫu thí nghiệm 100g, bổ sung 100 ml nước, xay nhỏ đến kích thước khoảng 2-3mm.
Bổ sung acid HCl vào mẫu với nồng độ đã xác định ở mục 2.2.2, các mẫu
được tiến hành xác định thời gian thủy phân trong 0h; 1h; 2h; 3h; 4h; 5h.Tiến hành
ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã. Thu hồi caroten-protein từ phần dịch
bằng cách kết hợp cả ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 700C/10
phút và bổ sung chitosan 100ppm), sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong
15 phút với tốc độ 3500 vòng [15]. Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng
carotenoid có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra thời gian xử lý acid
HCl thích hợp.
Hình 2.4.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý acid HCl
Chỉ tiêu đánh giá : Hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin. Xử lý sơ bộ
0 giờ 1 giờ 2 giờ 3 giờ 4 giờ 5 giờ
Đầu tôm nguyên liệu
Bổ sung acid HCl với nồng độ xác định ở thí nghiệm 2.2.2
Xác định thời gian xử lý
Lựa chọn thời gian xử lý thích hợp Thu hồi hỗn hợp caroten-protein
Đánh giá hiệu suất thu hồivà xác định hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein
Kết quả thăm dò : Chọn thời gian xử lí HCl thích hợp để đạt hiệu quả thu hồi cao và chất lượng hỗn hợp caroten-protein giàu carotenoid nhất.
2.2.4. Xác định nồng độ acid lactic
Mục đích : Xác định nồng độ acid lactic thích hợp để tách chiết hỗn hợp caroten-protein đạt hiệu quả cao nhất.
Tiến hành thí nghiệm:
Đầu tôm thẻ chân trắng được rửa sạch, loại bỏ tạp chất, để ráo. Cân 100g , bổ sung thêm 100 ml nước, xay nhỏ mẫu với kích thước 2-3 mm để tạo điều kiện enzyme tiếp xúc với cơ chất.
Bổ sung acid lactic vào mẫu để với các nồng độ khác nhau: 0%, 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1%. Sau đó tiến hành ủ trong 2 giờ. Tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã. Thu hồi caroten-protein từ phần dịch bằng cách kết hợp cả ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 700C/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng [15]. Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng carotenoid có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra nồng độ acid lactic thích hợp.
Chỉ tiêu đánh giá : Hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin.
Kết quả thăm dò : Chọn thời nồng độ acid lactic thích hợp để đạt hiệu quả thu hồi cao và chất lượng hỗn hợp caroten-protein giàu carotenoid nhất.
Hình 2.5.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid lactic 2.2.5. Xác định thời gian xử lý acid lactic
Mục đích: Xác định thời gian xử lí thích hợp của acid lactic cho quá trình thủy phân đạt hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin cao nhất.
Đầu tôm nguyên liệu
Xử lý sơ bộ
Xác định nồng độ acid lactic bổ sung
0,8%
0% 0,2% 0,4% 0,6% 1%
Thời gian xử lý 2 giờ
Thu hồi hỗn hợp caroten-protein
Lựa chọn nồng độ acid lactic thích hợp Đánh giá hiệu suất thuhồi và xác định hàm
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý acid lactic
Tiến hành thí nghiệm:Đầu tôm thẻ chân trắng được rửa sạch, loại bỏ tạp chất, để ráo. Cân 100g, bổ sung thêm 100 ml nước, xay nhỏ mẫu với kích thước 2-3 mm để tạo điều kiện enzyme tiếp xúc với cơ chất.
Bổ sung acid lactic vào mẫu để với nồng độ thích hợp đã được xác định ở thí nghiệm 2.2.4, các mẫu được tiến hành xác định thời gian xử lý trong 0h; 1h; 2h; 3h;
Đánh giá hiệu suất thu hồi và xác
định hàm lượng astaxanthin
Đầu tôm nguyên liệu
Xử lý sơ bộ
Bổ sung acid lactic với nồng độ được xác định ở thí
nghiệm 2.2.4
Xác định thời gian xử lý
0 giờ 1 giờ 2 giờ 3 giờ 4 giờ 5 giờ
Lựa chọn thời gian xử lý thích hợp Thu hồi hỗn hợp caroten-protein
4h; 5h. Sau đó tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã. Thu hồi caroten-protein từ phần dịch bằng cách kết hợp cả ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 700C/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng [15]. Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng carotenoid có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra thời gian xử lý acid lactic thích hợp.
Chỉ tiêu đánh giá : Hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin.
Kết quả thăm dò: Chọn thời gian xử lý thích hợp của acid lactic trong quá trình thủy phân để đạt hiệu quả thu hồi cao và chất lượng hỗn hợp caroten-protein giàu carotenoid nhất.
2.3. Các phương pháp phân tích, kiểm tra.
1. Độ ẩm, hàm lượng khoáng được phân tích theo phương pháp chuẩn của AOAC.
2. Xác định hàm lượng protein tổng số của chế phẩm caroten-protein bằng phương pháp Kjeldahl.
3. Xác định hàm lượng astaxanthin tổng số bằng phương pháp quang phổ. 4. Hiệu suất thu hồi chế phẩm được tính theo phương pháp của Dauphin cụ thể: Hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein (%) = (M*100)/M0; M: Khối lượng hỗn hợp caroten-protein thu được (g); M0: Khối lượng nguyên liệu (g).
2.4. Phương pháp xử lý số liệu.
Số liệu báo cáo là trung bình của 3 lần phân tích. Kết quả được xử lý bằng phần mền Excel và SPSS 16.0. Giá trị của p < 0,05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu
Phân tích thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng như protein hay hàm lượng carotenoid là cần thiết để có thể xem xét có nên tiến hành thu hồi hỗn hợp caroten-protein. Điều này giúp nghiên cứu được thực hiện hiệu quả tránh mất thời gian tập trung vào nguồn nguyên liệu có giá trị thấp.
Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng được phân tích và kết quả trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng
Chỉ tiêu Hàm lượng* Protein (%) 52,6 ± 2,2 Khoáng (%) 15,1 ± 0,9 Lipid (%) 8,2 ± 0,4 Carotenoid (mg/kg) 163 ± 8,2 Chitin (%) 15,1 ± 0,9
* Kết quảtính theo hàm lượng chất khô tuyệt đối.
Thành phần hóa học chính của đầu tôm thẻ chân trắng là protein, khoáng, lipid và chitin, trong đó protein chiếm hàm lượng lớn nhất (khoảng 52%). Ngoài ra trong đầu tôm có carotenoid, tuy chiếm một lượng rất nhỏ nhưng có hoạt tính sinh học cao. So với kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng của Phạm Thị Đan Phượng [11], cho thấy đa số các thành phần protein, carotenoid, chitin cao hơn, ngược lại có hàm lượng lipid và chitin thấp hơn. Có sự khác biệt đó là do chất lượng nguyên liệu và phương pháp phân tích khác nhau nên các thành phần hóa học đầu tôm khác nhau.
3.2. Điều kiện xử lý đầu tôm thích hợp acid HCl
Điều kiện thủy phân thích hợp của acid HCl để xử lý đầu tôm nhằm thu hồi chế phẩm caroten-protein được xác định. Kết quả nghiên cứu điều kiện xử lý thích hợp của từng acid đối với đầu tôm được trình bày ở các phần sau.
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid HCl sử dụng đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein
Thực hiện thí nghiệm theo sơ đồ bố trí thí nghiệm số 2.2.2 xác định ảnh hưởng
