1.8.1. Acid lactic
Acid lactic là hợp chất hữu cơ thu được bằng phương pháp lên men do tác nhân chủ yếu là vi sinh vật.
Acid lactic (tên IUPAC: 2-hydroxypropanoic acid) hay acid sữa là một hợp chất hóa học đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh hóa. Acid lactic là một acid carboxylic với công thức hóa học C3H6O3, có một nhóm hydroxyl đứng gần nhóm carboxyl, làm cho nó có một alpha hydroxy acid (AHA). Trong dung dịch, nó có thể mất một proton từ nhóm acid tạo ra lactate CH3CH(OH)COO− có thể tan với nước hoặc ethanol.
Trong công nghiệp, quá trình lên men acid lactic được thực hiện bởi vi khuẩn
Lactobacillus.
Trong y học, Lactate thường được sử dụng cho các chất lỏng hồi sức sau khi mất máu do chấn thương, phẫu thuật, hoặc một chấn thương đốt.
Tính chất: DL acid lactic là dịch lỏng dạng tinh thể, tan trong H2O, cồn, không tan trong CH3Cl, nhiệt độ nóng chảy 16,80C, nhiệt độ sôi 1220C.
- Acid lactic có khối lượng phân tử là 98,08; là chất hữu cơ không màu, mùi nhẹ. - Acid lactic là một chất có độ hút ẩm cao, chất lỏng sánh đặc có sẵn trên thị trường ở những dạng khác nhau về chất lượng, và phụ thuộc vào độ tinh sạch có nhiều tiêu chuẩn khác nhau: acid lactic kỹ thuật, thực phẩm, dược phẩm và acid lactic plastic.
- Chú ý là ở dạng đồng phần D-acid lactic hoặc L-acid lactic lần lượt có nhiệt độ nóng chảy là nhiệt độ sôi là 28 và 103 (0C).
- Một tiêu chuẩn chất lượng quan trọng của acid lactic tinh sạch cao là sự bền nhiệt, ví dụ: không màu tạo thành khi làm nóng dung dịch 80% acid lactic đến 1800C.
1.8.2. Acid formic
Acid formic (còn gọi là acid methanoic) là dạng acid carboxylic đơn giản nhất. Có công thức hóa học là HCOOH. Nó là một chất trung gian quan trọng trong tổng hợp hóa học và xảy ra tự nhiên, đáng chú ý nhất trong nọc độc của loài kiến.
Acid formic là một chất lỏng không màu và rất hăng, thấm mùi ở nhiệt độ phòng. Nó là có thể trộn với nước và hầu hết các vùng cực hữu cơ dung môi, và có phần hơi hòa tan tronghydrocarbon. Trong hydrocarbon và trong giai đoạn bay hơi, nó bao gồm tạo liên kết hydro nhị trùng hơn là các phân tử cá nhân. Do xu hướng của nó để kết hydro, acid formic khí không tuân theo khí lý tưởng .
1.8.3.Acid propionic
Acid propionic là một acid cacboxylic có nguồn gốc tự nhiên với công thức hóa họcCH3CH2COOH ( C3H6O2) Ở trạng thái tinh khiết và trong điều kiện thông thường, nó là một chất lỏng không màu có tính ăn mòn và mùi hăng.
Giống như acid formic, dạng khí của nó vi phạm nghiêm trọng định luật khí lý tưởng do nó không chứa các phân tử acid propionic riêng rẽ mà lại có các cặp liên kết hydro giữa các phân tử.
Acid propionic ngăn cản sự phát triển của mốc và một số vi khuẩn. Do vậy, phần lớn acid propionic được sản xuất để sử dụng làm chất bảo quản cho cả thực phẩm dành cho con người cũng như thức ăn dành cho gia súc.
1.9.Các phương pháp tách chiết hỗn hợp caroten-protein trong quá trình sản xuất chitin
1.9.1.Phương pháp vật lí
Đây là phương pháp làm giảm bớt hàm lượng protein trong phế liệu tôm trước khi đưa vào sản xuất chitin.
Sơ đồ quy trình
Nguyên liệu được lấy ở dạng tươi từ nhà máy chế biến, trong quá trình vận chuyển bảo quản lạnh, sử dụng 2 loại máy ép là máy ép trục vít, và máy ép roto. Kết quả thu được như sau:
Nhận thấy hàm lượng protein trong đầu tôm trước và sau khi ép có giảm, tuy hàm lượng protein còn lại là khá cao, nhưng cũng đã góp phần giảm bớt lượng protein trong phế liệu tôm trước khi đem sản xuất chitin, từ đó giảm được phần nào lượng hoá chất cần thiết sử dụng trong việc tách protein
Nguyên liệu vỏ đầu
Ép
Bã ép Dịch ép
Bảng 1.9. Hàm lượng protein của phế liệu tôm trước và sau khi ép [6] Nguyên liệu Hàm lượng protein trước khi ép (%) Hàm lượng protein còn lại sau khi ép bằng máy ép roto (%)
Hàm lượng protein còn lại sau khi ép bằng máy ép trục vít (%)
Đầu 25,8 21,8 18,3
Vỏ 23,9 18,7 17,5
1.9.2. Phương pháp hóa học
Phương pháp hóa học là phương pháp được sử dụng phổ biến trong quy trình sản xuất chitin - chitosan hiện nay.
Chitin không tồn tại độc lập mà nó thường liên kết với các thành phần khác như: Protein, khoáng, sắc tố… Vì vậy để thu được chitin cần phải loại bỏ các thành phần không phải là chitin trong phế liệu tôm.
- Khử khoáng: Khoáng trong phế liệu tôm tồn tại ở dạng muối CaCO3, Ca3(PO4)2. Để khử khoáng trong đầu và vỏ tôm, ta thường sử dụng các acid mạnh như acid chlohydric, hay acid sunfuric,… cũng có thể dùng acid formic để biến đổi các muối không tan thành các muối có thể tan được và tách ra [2].
Phương trình phản ứng:
CaCO3 + HCl CaCl2 + H2O + CO2 CaCO3 + H2SO4 CaSO4 + H2O + CO2
CaCO3 + HCOOH (HCOO)2Ca + H2O + CO2
Các nghiên cứu cho thấy rằng mức độ khử khoáng phụ thuộc vào nồng độ của acid được sử dụng.
- Khử protein:
Hóa chất được sử dụng để khử protein là NaOH, nồng độ NaOH sử dụng tùy thuộc vài loại nguyên liệu và tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch. Phương pháp này có
tcao
nhược điểm là thải ra môi trường một lượng NaOH rất lớn gây ô nhiễm môi trường, nồng độ NaOH thường dùng khoảng 6÷8% để khử protein. Phương trình phản ứng thủy phân protein trong môi trường kiềm.
H2N-CH-CO-NH-CH-CO H2N-CH-COOH + H2N-CH-CO-NH-CH- R1 R2 R1 R2 R3 polypeptid acid amin peptid
Phương pháp hóa học cho hiệu suất sản phẩm cao nhưng lại có nhược điểm thải ra môi trường một lượng lớn NaOH và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm sản xuất chitin - chitosan sau này. Do đó, với hóa chất nồng độ cao, hay nồng độ thấp nhưng thời gian dài, hay nhiệt độ cao… đều sẽ ảnh hưởng chất lượng sản phẩm sau này. Vì vậy cần có hướng nghiên cứu kết hợp thêm với phương pháp sinh học trong việc tận thu sản phẩm trong dịch thải có chất lượng tốt hơn, giảm được lượng hóa chất sử dụng, nâng cao chất lượng cho sản phẩm chitin - chitosan, mà còn giải quyết được ô nhiễm môi trường trong quá trình sản xuất về sau.
1.9.3. Phương pháp sinh học
Phương pháp này có thể sử dụng các loại enzyme khác nhau để thủy phân protein, từ đó protein sẽ được tách ra khỏi nguyên liệu. Điển hình là enzyme protease hay enzyme deacetylase để thay thế NaOH trong quy trình sản xuất chitin. Enzyme protease thường được sử dụng như là: Papain, Bromelin, và các enzyme động thực vật, vi sinh vật.
Enzyme deacetylase thu được từ quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Các vi sinh vật này thường tồn tại nhiều trên vỏ tôm, đặc biệt là vỏ tôm, vỏ ghẹ đang phân hủy. Người ta có thể tìm thấy tại đây có cả vi sinh vật sinh ra chitinase và chitosanase. Lợi ích của phương pháp sinh học này là sản xuất trong điều kiện nhiệt độ và áp suất tự nhiên, dung lượng thấp, bảo vệ được các sản phẩm phụ và những tác dụng đặc trưng [8].
Tuy nhiên, do chi phí của phương pháp này cao, khá tốn kém, vì cần phải nghiên cứu để sản xuất ra enzyme để có thể sử dụng với một số lượng lớn trong sản xuất chitin. Nên hiện nay phương pháp sinh học vẫn chưa được áp dụng phổ biến và rộng rãi như là phương pháp hóa học trong sản xuất chitin – chitosan.
1.10. Phương pháp thu hồi caroten – protein
1.10.1. Phương pháp thu hồi caroten – protein bằng pH
Điểm đẳng điện của protein (pI) là giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa về điện, ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa điện, điện tích của protein bằng không, tương tác tĩnh điện giữa các phân tử protein và các phân tử nước bị giảm. Các phân tử protein tập hợp lại với nhau do lớp vỏ hydrat bên ngoài bị phá vỡ. Người ta lợi dụng tính chất này để kết tủa protein. Do không có sự thay đổi cấu trúc phân tử nên sau khi loại bỏ tác nhân gây kết tủa ra khỏi dung dịch thì các phân tử protein có thể hòa tan trở lại [14]. Cơ chế kết tủa bằng pH đẳng điện có thể mang tính thuận nghịch nên áp dụng để tách hợp chất protein có hoạt tính sinh học ra khỏi hỗn hợp mà vẫn đảm bảo giữ được hoạt tính và cấu trúc phân tử.
1.10.2. Phương pháp thu hồi caroten – protein bằng nhiệt độ
Phương pháp thu hồi protein bằng xử lý nhiệt là phương pháp mà khi sử dụng nhiệt độ cao sẽ loại bỏ được lớp vỏ hydrat của protein, làm giảm khả năng hấp thụ của nước. Nhờ đó các phân tử protein kết tụ lại với nhau thành khối. Do mỗi loại protein khác nhau thì có độ biến tính khác nhau vì vậy độ biến tính của protein tỷ lệ thuận vào cường độ và thời gian khác nhau. Đa số protein biến tính ở nhiệt độ 45 – 500C. Protein khi được gia nhiệt ở điểm đẳng điện sẽ cho kết tủa nhanh hơn.
Việc kết tủa protein bằng nhiệt có rất nhiều ưu điểm trong việc tách protein từ dung dịch mà khi chúng ta ít quan tâm đến hoạt tính hay cấu trúc của nó. Phương pháp kết tủa này xảy ra nhanh, triệt để, ít gây ô nhiễm môi trường.
1.10.3. Phương pháp thu hồi caroten – protein bằng chất trợ lắng (chitosan)
Chitosan mang tính chất đặc trưng của điện tích dương nên có thể tương tác với phần lớn các chất hữu cơ mang điện tích âm. Nó thể hiện là một chất keo tụ, tạo bông tốt, có hiệu quả trong việc thu hồi các chất hữu cơ trong nước và đặc biệt là
protein. Phân tử chitosan cũng có khả năng hấp phụ, tạo cầu nối để liên kết các hạt keo protein đã kết tủa thành các phân tử có kích thước lớn hơn và lắng. Ngoài ra, chitosan còn có độ deacetyl cao thì trong dung dịch có chứa nhiều gốc amin tích điện dương sẽ trung hòa điện tích của các phân tử protein tích điện âm trong dung dịch nước rửa, giảm khả năng hydrat hóa, tập hợp lại và kết tụ [15]. Nồng độ chitosan cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả thu hồi, cần sử dụng chitosan ở một nồng độ hợp lý vì khi tăng nồng độ chitosan làm tăng số điện tích cùng dấu và đẩy nhau tạo nên một mạng lưới keo cản trở quá trình keo tụ lắng xuống của các phân tử protein. Chitosan có độ deacetyl hóa càng cao thì các nhóm tích điện dương trên mạch chitosan càng nhiều, thuận lợi trong tương tác ion để thu hồi protein hòa tan.
Ưu điểm của phương pháp này là không gây biến tính protein, không độc hại và hiệu quả thu nhận cao. Do đó phương pháp này áp dụng để tận thu các chế phẩm enzyme và các hợp chất có hoạt tính sinh học.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nguyên cứu
2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng
Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được lấy tại phân xưởng chế biến Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Chất lượng đầu tôm tươi, không bị biến đổi màu sắc như đen đầu hay đỏ đầu, không bẩn nhiễm rác và tạp chất, được lưu giữ lạnh bằng thùng xốp cách nhiệt (<50C) với đá khô khi đưa về phòng thí nghiệm. Phế liệu tôm trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo. Trong trường hợp chưa thí nghiệm ngay thì bao gói bảo quản đông trong điều kiện nhiệt độ - 200C.
Hình 2.1. Đầu tôm thẻ chân trắng
Lưu ý, chỉ sử dụng đầu tôm và không sử dụng vỏ tôm vì hàm lượng caroten- protein trong vỏ rất ít.
2.1.2.Acid HCl
Thông thường người ta dùng acid clohydric công nghiệp để thủy phân. Dùng HCl để thủy phân có ưu điểm hơn các hóa chất khác vì dịch thủy phân cho màu sắc đẹp, NH3 ít và sự tổn thất acid amin cũng ít [16].
Ở cùng điều kiện pH, nhiệt độ khi dùng H2SO4 thủy phân thì nhanh hơn HCl, giá thành cũng không đắt hơn nhiều nhưng màu sắc của dịch thủy phân xấu, có nhiều NH3 và mất đi một số acid amin như tryptophan vì H2SO4 có tính chất oxy hóa [16].
Dùng NaOH thủy phân cũng nhanh hơn HCl nhưng nó khử đi một số acid amin. Còn dùng Na2CO3 thủy phân thì chậm nhất và dung dịch thủy phân xong trung hòa tới pH=7 thì lượng acid phải tiêu tốn nhiều hơn lượng Na2CO3 đem thủy phân [16].
Vì vậy dùng HCl thủy phân là tốt hơn cả.
2.1.3. Acid lactic
Việc sử dụng các acid hữu cơ như acid lactic để bảo quản phế liệu từ nguyên liệu tươi đã được dùng trong thực phẩm bắt đầu từ rất lâu và rất phổ biến. Theo Windsor và Barlow (1981) sử dụng nguyên liệu hoặc phế liệu thủy sản để ủ xi lô là một dạng thức ăn cho động vật nuôi vừa rẻ lại vừa đơn giản [29]. Trong suốt thời gian ủ, enzyme nội tại phân giải protein sẽ phá vỡ cấu trúc tế bào phân tử protein hình thành nên các peptid, amino acid với khả năng hòa tan và ổn định trong dịch ủ.Đồng thời, acid lactic là tác nhân chính trong quá trình lên men lactic. Các chủng lactic có mặt trong sản phẩm sẽ làm thay đổi các tính chất cảm quan và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Các sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men sẽ ức chế sự hoạt động của đa số các vi sinh vật gây thối khác, do đó làm tăng tính an toàn và kéo dài thời gian bảo quản của sản phẩm.
Acid lactic đáp ứng được ưu điểm của một acid hữu cơ, đồng thời giá thành phù hợp cho việc có thể áp dụng vào trong sản xuất công nghiệp. Việc lựa chọn acid
lactic để áp dụng vào thí nghiệm nói riêng và trong sản xuất công nghiệp nói chung là điều hợp lý và cần thiết.
2.1.4.Dụng cụ, hóa chất
Các loại acid như acid clohydric, acid lactic, hexan, isopropanol, BHT, chitosan, ete dầu mỏ. Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết được dùng cho phân tích.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Thuyết minh quy trình :
Nguyên liệu đầu tôm được làm sạch, loại bỏ rác, phần ươn hỏng,bổ sung 100 ml nước, nghiền mẫu với kích thước 2-3 mm, nhằm tăng diện tích tiếp xúc trong quá trình thủy phân.
Sau đó, tiến hành thủy phân bằng cách bổ sung acid HCl hoặc acid lactic với nồng độ và thời gian xử lý thích hợp. Tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã. Phần bã được rửa bằng nước sạch, nước rửa được thu hồi cùng với phần dịch. Phần bã được đưa sang công đoạn sản xuất chitin, chitosan còn phần dịch được tiếp tục thu hồi chế phẩm caroten-protein. Xác định các yếu tố như nồng độ acid lactic, acid HCl, thời gian xử lý tối ưu của quá trình thủy phân được xác định thông qua hiệu suất thu hồi chế phẩm carotein-protein và hàm lượng carotenoid.
Quá trình thu hồi caroten-protein được thực hiện bằng phương pháp kết hợp giữa kết tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện và xử lý nhiệt, đồng thời có thể bất hoạt được enzyme để kết thúc quá trình thủy phân, ngoài ra trong quá trình này có sử dụng chitosan đóng vai trò là chất tạo tủa và keo tụ để tăng hiệu quả quá trình kết tủa protein theo nghiên cứu của Trang Sĩ Trung [15]. Cụ thể: dịch thủy phân chứa caroten-protein được điều chỉnh pH về pH 4,3-4,5 bằng HCl 10% để kết tủa protein, gia nhiệt 700C/10 phút, bổ sung chitosan ở nồng độ 100 ppm. Sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng/phút.
Hình2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Thu hồi hỗn hợp caroten-protein và đánh giá hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp.
Phân riêng Đầu tôm nguyên liệu
Xử lý sơ bộ
Xác định nồng độ acidHCl
Xác định thời gian xử lý acid lactic
Phần dịch thủy phân
Thu hồi hỗn hợp caroten-protein Phần bã
Xác định nồng độ acid lactic
Xác định thời gian xử lý acid HCl
Sản xuất chitin-