Ethanol toàn phần của thân Đơn châu chấu
Súc vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả 2 giống,
khoẻ mạnh, trọng lƣợng 20±2g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp. Súc vật đƣợc nuôi trong điều kiện đầy đủ về thức ăn, nƣớc uống, nhiệt độ phòng, chiếu sáng tự nhiên.
Tiến hành: Khảo sát tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa trên mô
hình gây độc gan bằng CCl4.
Nguyên tắc: CCl4 là chất gây tổn thƣơng gan kinh điển. Bản thân CCl4
không độc, nhƣng khi vào cơ thể, nó biến đổi thành các gốc tự do, các gốc này thúc đẩy quá trình peroxy hoá lipid của màng tế bào gan (POL), tạo ra sản phẩm độc cho tế bào gan, biểu hiện bằng gây tăng men gan trong máu và tăng MDA (Malonyl dialdehyd – là sản phẩm của quá trình POL).
Chuẩn bị mẫu thử: tiến hành chiết xuất dƣợc liệu theo mục 3.2.2. Cao Ethanol toàn phần đƣợc hòa vào nƣớc, sau đó cho chuột uống. Mô hình cụ thể nhƣ sau:
Chuột nhắt trắng đƣợc chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô10 con.
- Lô 1 (lô chứng sinh lý): uống nƣớc cất, thể tích 0,2 ml/10g chuột + tiêm dầu oliu, liều 0,2 ml/20g chuột.
- Lô 2 (lô chứng bệnh lý): uống nƣớc cất, thể tích 0,2 ml/10g chuột + tiêm dung dịch CCl4 7% pha trong dầu oliu, liều 0,2 ml/20g chuột. - Lô 3 (lô thử 1): uống cao cồn liều 6g dƣợc liệu/kg + tiêm dung dịch
CCl4 7% pha trong dầu oliu, liều 0,2 ml/20g chuột.
- Lô 4 (lô thử 2): uống cao cồn liều 12g dƣợc liệu/kg + tiêm dung dịch CCl4 7% pha trong dầu oliu, liều 0,2 ml/20g chuột.
- Lô 5 (lô chứng dƣơng): uống silymarin liều 100mg/kg + tiêm dung dịch CCl4 7% pha trong dầu oliu, liều 0,2 ml/20g chuột.
Dung dịch CCl4 7% pha trong dầu oliu đƣợc tiêm cách 2 ngày một lần. Chuột đƣợc uống nƣớc cất hoặc thuốc thử liên tục trong 8 ngày. Đến ngày thứ 8, sau khi uống thuốc 1 giờ, giết chuột, lấy huyết thanh định lƣợng AST, ALT, bilirubin và lấy gan để định lƣợng MDA.
Định lƣợng MDA theo phƣơng pháp Wasowich và Balahoroglu [16], [59].
Nguyên tắc của phương pháp: là xác định hàm lƣợng malonyl dialdehyd (MDA), một trong những sản phẩm tạo ra bởi quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. Sản phẩm MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 532nm. Cƣờng độ màu của phức này tỉ lệ thuận với hàm lƣợng MDA.
Quy trình định lượng MDA được tóm tắt như sau: Ngày thứ 8: Sau khi uống thuốc 1 giờ, giết chuột, lấy gan định lƣợng MDA: cân 100 mg gan, nghiền đồng thể trong 1 ml dung dịch KCl 0,15 M. Hút 300 l dịch đồng thể cho vào ống nghiệm có 1ml H20, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25 % pha trong acid acetic, đun cách thủy nhiệt độ 100o
C trong 60 phút, để nguội, thêm 25 µl HCl 5N, lắc đều, thêm vào 3,5 ml n- buthanol, ly tâm 3000v/phút x 10 phút, hút phần n-buthanol đem đo quang ở bƣớc sóng 532 nm. Hàm lƣợng MDA đƣợc tính theo phƣơng trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA. Lƣợng MDA trong mẫu thử giảm so với đối chứng gây bệnh sẽ biểu hiện khả năng ức chế quá trình POL của mẫu thử.
Hàm lƣợng MDA trong dịch đồng thể đƣợc tính theo phƣơng trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn MDA.
Sau khi tính đƣợc hàm lƣợng MDA (nmol/ml dịch đồng thể), suy ra hàm lƣợng MDA/100mg gan (nmol/100mg gan).
Tính kết quả: đánh giá mức độ khác nhau giữa các lô theo phƣơng
pháp thống kê dùng trong sinh học t- Student, sử dụng phần mềm Microsoft – Excel.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật
3.1.1. Đặc điểm hình thái
Cây nhỏ, cao 1-2m, thƣờng có gai ngắn hơn 4mm. Lá mọc so le, kép lông chim 2-3 lần, với 1 cặp lá kèm đính ở cuống lá. Có 5-11 lá chét, phiến lá hình trứng, dài 3-8cm, rộng 2-3cm, cả 2 mặt có những gai nhỏ nhƣ sợi tơ, đặc biệt là trên gân lá. Gân phụ có 5-6 cặp, dễ thấy trên cả hai bề mặt, các gân hình mạng nhìn không rõ. Gốc lá hình tròn đến hình tim, đầu lá nhọn, mép lá có răng cƣa. Cuống lá dài 50-100cm, có bẹ lá. Cụm hoa dạng tán, mọc ở kẽ lá hay đầu cành. Mỗi tán có 20- 40 hoa, cuống hoa dài 1-1,5 cm với gai mỏng. Hoa nhỏ, màu lục vàng, có 5 tràng đều, rời nhau, dài 2-2,5mm, có gân ở giữa. Đài hình tam giác dài 1-1,5mm, 5 lá đài màu xanh dính liền nhau. Bộ nhị có 5 nhị rời nhau, nằm xen kẽ với tràng hoa. Chỉ nhị dài 3-4mm, bao phấn đính lƣng, dài 1mm, hƣớng ngoài, trên bao phấn có rãnh dọc. Bầu hình trứng, có 5 ô. Quả hạch, hình cầu, đƣờng kính 4 - 4,5mm, lúc non có màu xanh, khi chín có màu đen.
Đối chiếu với bản mô tả ghi trong các tài liệu phân loại thực vật, cây Đơn châu chấu đƣợc sơ bộ xác định thuộc chi Aralia L., họ Ngũ gia bì (Araliaceae) và đƣợc PGS.TS. Trần Văn Ơn – Bộ môn Thực vật, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội giám định tên khoa học là Aralia armata (Wall.ex G.Don) Seem., họ Ngũ gia bì (Araliaceae).
Hình 3.10: Ảnh hình thái cây Đơn châu chấu
1. Toàn cây; 2. Cành mang hoa, quả; 3. Hoa; 4. Đài; 5. Tràng hoa; 6. Nhị; 7. Hoa bổ dọc; 8.Cụm quả; 9,10. Quả; 11. Bầu cắt ngang.
1 2
3 4 5 6
7 8 9
3.1.2. Đặc điểm giải phẫu
3.1.2.1. Đặc điểm vi phẫu lá
Phần gân lá: Gân lá lồi nhiều ở cả hai mặt phía trên và dƣới. Biểu bì trên (2) và biểu bì dƣới (13) cấu tạo là một lớp tế bào tròn, tƣơng đối nhỏ, xếp đều đặn, mang gai nhỏ (1). Sát lớp biểu bì trên và dƣới là lớp mô dày (3) gồm 3-4 lớp tế bào hình tròn, thành dày. Mô mềm (4) gồm những tế bào hình trứng, thành mỏng, kích thƣớc lớn, không đều nhau, xếp lộn xộn. Nằm rải rác trong mô mềm có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (11). Bó libe-gỗ hình cung nằm giữa gân lá, libe (9) xếp thành vòng bao quanh gỗ, gỗ (10) cấu tạo bởi những mạch gỗ lớn xếp tập trung thành bó. Bao quanh bó libe gỗ có các ống tiết chất nhày (12).
Phần phiến lá: Biểu bì trên (5) và biểu bì dƣới (8) gồm một hàng tế bào hình chữa nhật xếp đều đặn. Mô giậu (6) cấu tạo bởi một lớp tế bào hình chữ nhật xếp thẳng đứng vuông góc với bề mặt lá. Mô khuyết gồm những tế bào thành mỏng, xếp lộn xộn (7).
Hình 3.11. Vi phẫu lá Đơn châu chấu Ghi chú:
Gân lá Phiến lá
1. Gai 5. Biểu bì trên 2. Biểu bì trên 6. Mô giậu 3. Mô dày 7. Mô khuyết 4. Mô mềm 8. Biểu bì dƣới 9. Libe
10. Gỗ
11. Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai 12. Ống tiết chất nhày
13. Biểu bì dƣới
3.1.2.2. Đặc điểm vi phẫu thân
Mặt cắt thân hình tròn, từ ngoài vào trong có: biểu bì (1) gồm một hàng tế bào đều đặn, thƣờng mang gai (11). Xếp sát biểu bì là mô dày gồm 4- 5 lớp tế bào hình tròn, kích thƣớc không đều, thành dày (2). Mô mềm vỏ (3) cấu tạo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
bởi vài lớp tế bào hình trứng, thành mỏng, kích thƣớc không đều nhau, sắp xếp lộn xộn. Nằm rải rác trong mô mềm vỏ có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (5) và các ống tiết chất nhày (4). Sát libe là các đám tế bào thành dày hóa gỗ (6). Libe cấu tạo từ các tế bào nhỏ, tập trung thành từng bó (7). Tầng phát sinh libe- gỗ (8). Bó gỗ gồm những mạch gỗ lớn (9), xếp thành hàng, tập trung thành bó. Các bó libe-gỗ kích thƣớc to nhỏ không đều nhau. Phía trong cùng là mô mềm ruột (10).
Ảnh chụp vi phẫu thân cây Đơn châu chấu đƣợc trình bày ở hình 3.12.
10
Hình 3.12. Vi phẫu thân cây Đơn châu chấu
Chú thích:
1. Biểu bì 2. Mô dày 3. Mô mềm vỏ 4. Ống tiết chất nhày
5. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
6. Đám tế bào thành dày hóa gỗ 7. Libe 8. Tầng phát sinh libe – gỗ 9. Gỗ 10. Mô mềm ruột 11. Gai 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9
(a) (b)
Hình 3.13. Tinh thể calci oxalat trong mô mềm vỏ của thân khi quan sát ở vật kính 40 (a), và vi phẫu gai Đơn châu chấu (b)
3.1.2.3. Đặc điểm vi phẫu rễ
Mặt cắt ngang hình tròn. Từ ngoài vào trong có: lớp bần (1) gồm 4 - 6 hàng tế bào hình chữ nhật, xếp đều đặn thành vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm. Mô mềm vỏ (2) cấu tạo từ những tế bào thành mỏng, phần ngoài thƣờng bị ép bẹt. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai nằm rải rác trong mô mềm vỏ và libe, có thể đứng riêng lẻ hoặc tập trung thành đám (3). Các tế bào libe nhỏ, xếp xít nhau thành bó (4). Tầng phát sinh libe gỗ (5). Mô gỗ gồm các mạch gỗ kích thƣớc không đều nhau, các bó gỗ xuất phát từ tâm (6).
Ảnh chụp vi phẫu rễ cây Đơn châu chấu đƣợc trình bày ở hình 3.14.
Hình 3.14. Vi phẫu rễ cây Đơn châu chấu
11 5 Ghi chú: 1. Bần 2. Mô mềm vỏ 3. Đám tinh thể calci oxalat hình cầu gai 4. Libe 5. Tầng phát sinh libe- gỗ 6. Gỗ 1 2 3 4 5 6
3.1.3. Đặc điểm bột dƣợc liệu
3.1.3.1. Đặc điểm bột lá Đơn châu chấu
Bột dƣợc liệu màu xanh xám, mùi hắc, vị chát.
Quan sát dƣới kính hiển vi thấy: Mảnh phiến lá mang mạch dẫn (1), mang tinh thể calci oxalat hình cầu gai (4) và mang mô giậu (2). Nhiều mảnh biểu bì mang lỗ khí (3). Rải rác có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai, tụ tập thành đám hoặc đứng riêng rẽ (8). Mảnh mạch xoắn (6), gai (5).
Ảnh chụp các đặc điểm bột lá Đơn châu chấu dƣới kính hiển vi đƣợc trình bày ở hình 3.15.
Hình 3.15. Một số đặc điểm bột lá Đơn châu chấu
Chú thích: 1. Mảnh phiến lá mang mạch dẫn 2. Mảnh phiến lá mang mô giậu 3. Mảnh biểu bì mang lỗ khí
4. Mảnh phiến lá mang tinh thể calci oxalat hình cầu gai 5. Gai, 6. Mạch xoắn
3.1.3.2. Đặc điểm bột thân Đơn châu chấu
Bột màu trắng đục, không mùi, không vị
Quan sát dƣới kính hiển vi thấy: Mảnh bần gồm các tế bào hình đa giác (4), mảnh mô mềm cấu tạo từ những tế bào thành mỏng (1), có thể mang các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (2). Sợi đứng riêng rẽ hoặc tập trung thành bó (3). Mảnh mạch vạch (5), mạch xoắn, mạch vòng (6). Nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai đứng riêng lẻ hoặc tập hợp thành đám (7).
Ảnh chụp các đặc điểm bột thân Đơn châu chấu dƣới kính hiển vi đƣợc trình bày ở hình 3.16.
Hình 3.16. Một số đặc điểm bột thân Đơn châu chấu
Chú thích:
1. Mảnh mô mềm
2. Mảnh mô mang tinh thể calxi oxalat hình cầu gai
3. Bó sợi
4. Mảnh bần
5. Mảnh mạch vạch
6. Mảnh mạch xoắn, mạch vòng 7. Tinh thể calxi oxalat hình cầu gai
3.1.3.3. Đặc điểm bột rễ Đơn châu chấu
Bột màu nâu xám, mùi hắc, vị nhạt chát.
Quan sát dƣới kính hiển vi thấy: mảnh bần gồm nhiều tế bào hình chữ nhật xếp xít nhau (4). Mảnh mô mềm (3) cấu tạo từ những tế bào thành mỏng, thƣờng chứa tinh bột (2) hoặc mang tinh thể calxi oxalat hình cầu gai (1). Các hạt tinh bột tròn, có rốn hạt rõ, nằm rải rác hoặc tập trung thành đám (9). Sợi dài, thành hơi dày, nằm riêng lẻ hoặc tập trung thành bó (5). Mảnh mạch chủ yếu là mạch vạch (8) và mạch xoắn (7). Các tế bào thành dày hóa gỗ, hình dạng không nhất định, đa số là hình đa giác nhiều cạnh, có khi hình tròn, thƣờng đứng rời nhau, có khi tụ lại thành đám (6). Các tinh thể calci oxalat hình cầu gai nằm rải rác (10).
Ảnh chụp các đặc điểm bột rễ Đơn châu chấu dƣới kính hiển vi đƣợc trình bày ở hình 3.17.
Chú thích:
1. Mảnh mô mềm mang tinh thể canxi oxalat hình cầu gai 2. Mảnh mô mềm mang tinh bột 3. Mảnh mô mềm
4. Bần 5. Bó sợi
3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Đơn châu chấu bằng phản ứng hóa học phản ứng hóa học
Định tính saponin
Phản ứng tạo bọt
Cho vào ống nghiệm dung tích 20ml khoảng 1g bột dƣợc liệu, thêm vào 5ml nƣớc, đun sôi nhẹ, lọc dịch lọc vào một ống nghiệm to và lắc mạnh theo chiều dọc ống trong 5 phút, để yên quan sát.
Kết quả: cột bọt xuất hiện và bền trong 15 phút ở cả ba mẫu rễ, thân, lá Đơn châu chấu (phản ứng dƣơng tính).
Phản ứng Salkowski
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn. Để nghiêng ống nghiệm 450
, cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml acid sulfuric đặc.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá Đơn châu chấu đều xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng (phản ứng dƣơng tính).
Phản ứng phân biệt saponin
Lấy 2 ống nghiệm 10ml, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1 N (pH=1) vào ống thứ hai 5ml NaOH 0,1 N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dịch chiết cồn rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 3 phút. Ðể yên sau 15 phút.
6. Đám tế bào thành dày hóa gỗ 7. Mảnh mạch xoắn
8. Mảnh mạch vạch 9. Đám hạt tinh bột
Kết quả: sau 15 phút thấy cột bọt ở hai ống nghiệm đều cao ngang nhau ở cả ba mẫu rễ, thân, lá.
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, lá Đơn châu chấu đều có saponin triterpenoid.
Định tính flavonoid
Cho 5g bột dƣợc liệu vào bình nón, thêm 50ml cồn 900, đun cách thủy đến sôi trong 10 phút, lọc nóng. Dịch lọc thu đƣợc đem làm phản ứng định tính flavonoid.
Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda hay Willstater)
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết cồn, thêm một ít bột magie và nhỏ từ từ 4-5 giọt dung dịch HCl đặc. Đun cách thủy trong 5 phút.
Kết quả: Dịch chiết không chuyển sang màu đỏ ở cả ba mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính).
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết cồn, sau đó thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%
Kết quả: dung dịch chuyển sang màu xanh đen rõ ở cả ba mẫu rễ, thân, lá (phản ứng dƣơng tính).
Phản ứng với dung dịch kiềm
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết cồn, sau đó thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Ở cả ba mẫu rễ, thân, lá đều xuất hiện kết tủa vàng. Tiếp tục thêm 1ml nƣớc cất, lắc đều lên.
Kết quả: tủa tan hết và màu vàng của dung dịch đậm lên (phản ứng dƣơng tính).
Phản ứng với hơi NH3
Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết cồn lên hai miếng giấy lọc, sấy nhẹ đến khô. Quan sát dƣới ánh sáng thƣờng thấy màu vàng. Đem hơ một miếng giấy lọc lên miệng lọ amoniac đặc đã mở nút.
Kết quả: ở cả ba mẫu rễ, thân, lá, màu vàng của dịch chiết trên giấy lọc đem hơ đều đậm hơn so với vết dịch chiết trên tờ giấy lọc còn lại (phản ứng dƣơng tính).
Phản ứng diazo hóa
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm khoảng 2ml dung dịch natri hydroxyd 10%, thêm vài giọt thuốc thử diazoni mới pha, lắc đều, đun nóng cách thủy trong 5 phút.
Kết quả: dịch chiết rễ, thân, lá đều xuất hiện màu đỏ gạch (phản ứng dƣơng tính)
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, lá của Đơn châu chấu có thể có flavonoid.
Định tính coumarin
Lấy 10g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 250ml, thêm 100ml cồn 900
,đun cách thủy đến sôi trong 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Các dịch chiết thu đƣợc đem làm các phản ứng sau:
Phản ứng mở và đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml dịch lọc + Ống nghiệm 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% + Ống nghiệm 2: để nguyên
Đun cả hai ống nghiệm trên nồi cách thủy đến sôi. Quan sát thấy:
+ Ống nghiệm 1: xuất hiện tủa đục vàng + Ống nghiệm 2: trong suốt
Thêm vào cả 2 ống, mỗi ống 1ml nƣớc cất, lắc đều