2.3.1. Nghiên cứu về thực vật
Đặc điểm hình thái: quan sát, mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu tại thực địa, chụp ảnh, thu hái và làm tiêu bản mẫu khô. Đối chiếu mẫu cây thu hái với các tài liệu phân loại thực vật để xác định tên khoa học.
Đặc điểm vi học: nghiên cứu đặc điểm vi học theo tài liệu Thực tập dƣợc liệu (phần vi học) [3], [11]. Cụ thể: sau khi thu hái, mẫu đƣợc đem xử lý bằng các phƣơng pháp thích hợp rồi nghiên cứu:
- Vi phẫu: tiến hành làm tiêu bản vi phẫu theo các bƣớc sau: + Chọn mẫu thích hợp.
+ Cắt tiêu bản bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay.
+ Xử lý lát cắt: lựa chọn những lát cắt mỏng, tẩy bằng dung dịch javen, rửa sạch bằng nƣớc cất, tẩy tiếp bằng chloralhydrat 75%, rửa lại bằng nƣớc cất, ngâm trong acid acetic 5%, rửa bằng nƣớc cất đến hết acid. Sau đó tiến hành nhuộm kép với xanh methylen và đỏ son phèn.
glycerin : nƣớc (1:1) rồi quan sát dƣới kính hiển vi, mô tả đặc điểm giải phẫu, chụp ảnh bằng máy ảnh qua kính hiển vi.
- Bột dược liệu:
+ Mẫu nghiên cứu đƣợc sấy khô, nghiền thành bột. + Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi để xác định màu, mùi, vị.
+ Lên tiêu bản bột dƣợc liệu bằng dung dịch glycerin : nƣớc (1:1), quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột qua kính hiển vi. Ảnh các đặc điểm đƣợc chuyển vào máy vi tính, ghép thành ảnh hoàn chỉnh.
2.3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
- Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong mẫu nghiên cứu bằng các phản ứng hóa học theo tài liệu Thực tập dƣợc liệu (phần hóa học) [2].
- Chiết xuất các hoạt chất trong dƣợc liệu bằng cồn công nghiệp. Cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cắn cồn toàn phần.
- Chiết xuất phân đoạn từ dịch chiết cồn toàn phần bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-Hexan, Ethyl acetat, n-Buthanol.
- Phân lập các hợp chất trong mẫu cao dƣợc liệu bằng sắc kí cột với chất hấp phụ là silica gel, cỡ hạt 0,04 - 0,063mm. Theo dõi các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng.
- Xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc bằng việc phân tích các đặc điểm hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và dựa trên số liệu các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR).
2.3.3. Nghiên cứu về tác dụng sinh học
2.3.3.1. Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao Ethanol toàn phần của thân Đơn châu chấu phần của thân Đơn châu chấu
a) Phương pháp xác định khả năng dọn gốc tự doDPPH
Nguyên tắc: Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH (α,α- diphenyl-β-picrylhydrazyl) là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình ôxy-hóa bằng sự chuyển các gốc tự do của DPPH sang trạng thái ổn định hơn. Nhƣ vậy, khi có mặt của chất chống ôxy hóa, nó sẽ khử gốc tự do của DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm đi. Kết quả đƣợc đọc ở bƣớc sóng 517 nm.
Cơ chế phản ứng:
Z. + AH = ZH + A.
Trong đó: Z.: là gốc tự do DPPH, AH là chất chống ôxy hóa
DPPH mang gốc tự do DPPH ở trạng thái ổn định
Tiến hành
- Pha dung dịch DPPH 150 μM trong methanol. Dung dịch này không bền với ánh sáng, chỉ pha trƣớc khi dùng.
- Mẫu thí nghiệm (MT1): đƣợc pha trong methanol với thang nồng độ khác nhau, sử dụng quercetin làm chứng dƣơng.
MT1: 1000,0; 500,0; 250,0; 125,0; 62,5 và 31,25 (μg/ml) Quercetin: 200,0; 40,0; 8,0; 1,6; 0,32 (μg/ml)
Hỗn hợp phản ứng pha theo bảng 2.1
Bảng 2.1. Hỗn hợp phản ứng trong thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH
Ống Dung dịch thử pha
trong MeOH (μl)
MeOH
(μl)
Dung dịch DPPH
150 μM (μl)
Trắng của mẫu chứng 0 100 0
Trắng của mẫu thử 10 90 0
Chứng 0 10 90
Thử 10 0 90
Quercetin 10 0 90
Hỗn hợp sau khi pha đƣợc ủ ở 37oC trong 30 phút. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems tại bƣớc sóng 517 nm.
b)Phương pháp xác định khả năng dọn gốc tự do superoxid
Thực hiện theo phƣơng pháp của Nishimiki (1972) [43]
Nguyên tắc
Gốc superoxid đƣợc tạo thành trong hệ nonenzymatic phenazine methosulfate-nicotinamide adenine dinucleotid (PMS/NADH), sau đó nó bị khử bởi NBT thành formazan có màu tím, đƣợc đo ở bƣớc sóng 560 nm. Những chất chống oxy hóa làm giảm sự hấp thu ở bƣớc sóng 560 nm là có khả năng tiêu diệt gốc tự do superoxid trong hỗn hợp phản ứng.
Tiến hành
- Mẫu thí nghiệm (MT2): đƣợc pha trong methanol với thang nồng độ khác nhau, sử dụng Superoxide dismutase làm chứng dƣơng.
MT2: 2000,0; 1000,0; 500,0; 250,0; 125,0 μg/ml
Superoxide dismutase: 5 unit; 4 unit; 3 unit; 2 unit; 1unit - Hỗn hợp phản ứng pha theo bảng 2.2
Bảng 2.2. Hỗn hợp phản ứng trong thử nghiệm dọn gốc tự do superoxid
Ống Trắng của
mẫu chứng
Trắng của
mẫu thử Chứng Thử Mẫu nghiên cứu pha bằng
methanol (ml) 0 1 0 1 Methanol (ml) 1 0 1 0 Đệm phosphat PH= 7,4 0,1 0,1 0 0 NBT 100 μM (ml) 1 1 1 1 NADH 468 μM (ml) 1 1 1 1 PMS 60 μM (ml) 0 0 0,1 0,1
Các mẫu NBT 100 μM, NADH 468 μM (ml) và PMS 60 μM (ml) đều đƣợc pha trong đệm phosphat PH=7.4
Hỗn hợp sau khi pha đƣợc ủ ở 37o
C trong 15 phút. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems tại bƣớc sóng 560nm.
Tính toán kết quả - Hoạt tính dọn gốc DPPH và superoxid (% ức chế) % Ức chế= ( ODchứng - OD thử) OD chứng x 100 OD: độ hấp thụ - Cách tính giá trị IC50
Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ % dọn gốc tự do theo nồng độ khảo sát của mẫu thử nghiệm bằng phần mềm Excel. Từ đồ thị, tính đƣợc giá trị IC50dựa vào tính phƣơng trình hồi quy tuyến tính.
2.3.3.2. Khảo sát tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa in vivo của cao Ethanol toàn phần của thân Đơn châu chấu Ethanol toàn phần của thân Đơn châu chấu
Súc vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả 2 giống,
khoẻ mạnh, trọng lƣợng 20±2g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp. Súc vật đƣợc nuôi trong điều kiện đầy đủ về thức ăn, nƣớc uống, nhiệt độ phòng, chiếu sáng tự nhiên.
Tiến hành: Khảo sát tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa trên mô
hình gây độc gan bằng CCl4.
Nguyên tắc: CCl4 là chất gây tổn thƣơng gan kinh điển. Bản thân CCl4
không độc, nhƣng khi vào cơ thể, nó biến đổi thành các gốc tự do, các gốc này thúc đẩy quá trình peroxy hoá lipid của màng tế bào gan (POL), tạo ra sản phẩm độc cho tế bào gan, biểu hiện bằng gây tăng men gan trong máu và tăng MDA (Malonyl dialdehyd – là sản phẩm của quá trình POL).
Chuẩn bị mẫu thử: tiến hành chiết xuất dƣợc liệu theo mục 3.2.2. Cao Ethanol toàn phần đƣợc hòa vào nƣớc, sau đó cho chuột uống. Mô hình cụ thể nhƣ sau:
Chuột nhắt trắng đƣợc chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô10 con.
- Lô 1 (lô chứng sinh lý): uống nƣớc cất, thể tích 0,2 ml/10g chuột + tiêm dầu oliu, liều 0,2 ml/20g chuột.
- Lô 2 (lô chứng bệnh lý): uống nƣớc cất, thể tích 0,2 ml/10g chuột + tiêm dung dịch CCl4 7% pha trong dầu oliu, liều 0,2 ml/20g chuột. - Lô 3 (lô thử 1): uống cao cồn liều 6g dƣợc liệu/kg + tiêm dung dịch
CCl4 7% pha trong dầu oliu, liều 0,2 ml/20g chuột.
- Lô 4 (lô thử 2): uống cao cồn liều 12g dƣợc liệu/kg + tiêm dung dịch CCl4 7% pha trong dầu oliu, liều 0,2 ml/20g chuột.
- Lô 5 (lô chứng dƣơng): uống silymarin liều 100mg/kg + tiêm dung dịch CCl4 7% pha trong dầu oliu, liều 0,2 ml/20g chuột.
Dung dịch CCl4 7% pha trong dầu oliu đƣợc tiêm cách 2 ngày một lần. Chuột đƣợc uống nƣớc cất hoặc thuốc thử liên tục trong 8 ngày. Đến ngày thứ 8, sau khi uống thuốc 1 giờ, giết chuột, lấy huyết thanh định lƣợng AST, ALT, bilirubin và lấy gan để định lƣợng MDA.
Định lƣợng MDA theo phƣơng pháp Wasowich và Balahoroglu [16], [59].
Nguyên tắc của phương pháp: là xác định hàm lƣợng malonyl dialdehyd (MDA), một trong những sản phẩm tạo ra bởi quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. Sản phẩm MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 532nm. Cƣờng độ màu của phức này tỉ lệ thuận với hàm lƣợng MDA.
Quy trình định lượng MDA được tóm tắt như sau: Ngày thứ 8: Sau khi uống thuốc 1 giờ, giết chuột, lấy gan định lƣợng MDA: cân 100 mg gan, nghiền đồng thể trong 1 ml dung dịch KCl 0,15 M. Hút 300 l dịch đồng thể cho vào ống nghiệm có 1ml H20, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25 % pha trong acid acetic, đun cách thủy nhiệt độ 100o
C trong 60 phút, để nguội, thêm 25 µl HCl 5N, lắc đều, thêm vào 3,5 ml n- buthanol, ly tâm 3000v/phút x 10 phút, hút phần n-buthanol đem đo quang ở bƣớc sóng 532 nm. Hàm lƣợng MDA đƣợc tính theo phƣơng trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA. Lƣợng MDA trong mẫu thử giảm so với đối chứng gây bệnh sẽ biểu hiện khả năng ức chế quá trình POL của mẫu thử.
Hàm lƣợng MDA trong dịch đồng thể đƣợc tính theo phƣơng trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn MDA.
Sau khi tính đƣợc hàm lƣợng MDA (nmol/ml dịch đồng thể), suy ra hàm lƣợng MDA/100mg gan (nmol/100mg gan).
Tính kết quả: đánh giá mức độ khác nhau giữa các lô theo phƣơng
pháp thống kê dùng trong sinh học t- Student, sử dụng phần mềm Microsoft – Excel.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật
3.1.1. Đặc điểm hình thái
Cây nhỏ, cao 1-2m, thƣờng có gai ngắn hơn 4mm. Lá mọc so le, kép lông chim 2-3 lần, với 1 cặp lá kèm đính ở cuống lá. Có 5-11 lá chét, phiến lá hình trứng, dài 3-8cm, rộng 2-3cm, cả 2 mặt có những gai nhỏ nhƣ sợi tơ, đặc biệt là trên gân lá. Gân phụ có 5-6 cặp, dễ thấy trên cả hai bề mặt, các gân hình mạng nhìn không rõ. Gốc lá hình tròn đến hình tim, đầu lá nhọn, mép lá có răng cƣa. Cuống lá dài 50-100cm, có bẹ lá. Cụm hoa dạng tán, mọc ở kẽ lá hay đầu cành. Mỗi tán có 20- 40 hoa, cuống hoa dài 1-1,5 cm với gai mỏng. Hoa nhỏ, màu lục vàng, có 5 tràng đều, rời nhau, dài 2-2,5mm, có gân ở giữa. Đài hình tam giác dài 1-1,5mm, 5 lá đài màu xanh dính liền nhau. Bộ nhị có 5 nhị rời nhau, nằm xen kẽ với tràng hoa. Chỉ nhị dài 3-4mm, bao phấn đính lƣng, dài 1mm, hƣớng ngoài, trên bao phấn có rãnh dọc. Bầu hình trứng, có 5 ô. Quả hạch, hình cầu, đƣờng kính 4 - 4,5mm, lúc non có màu xanh, khi chín có màu đen.
Đối chiếu với bản mô tả ghi trong các tài liệu phân loại thực vật, cây Đơn châu chấu đƣợc sơ bộ xác định thuộc chi Aralia L., họ Ngũ gia bì (Araliaceae) và đƣợc PGS.TS. Trần Văn Ơn – Bộ môn Thực vật, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội giám định tên khoa học là Aralia armata (Wall.ex G.Don) Seem., họ Ngũ gia bì (Araliaceae).
Hình 3.10: Ảnh hình thái cây Đơn châu chấu
1. Toàn cây; 2. Cành mang hoa, quả; 3. Hoa; 4. Đài; 5. Tràng hoa; 6. Nhị; 7. Hoa bổ dọc; 8.Cụm quả; 9,10. Quả; 11. Bầu cắt ngang.
1 2
3 4 5 6
7 8 9
3.1.2. Đặc điểm giải phẫu
3.1.2.1. Đặc điểm vi phẫu lá
Phần gân lá: Gân lá lồi nhiều ở cả hai mặt phía trên và dƣới. Biểu bì trên (2) và biểu bì dƣới (13) cấu tạo là một lớp tế bào tròn, tƣơng đối nhỏ, xếp đều đặn, mang gai nhỏ (1). Sát lớp biểu bì trên và dƣới là lớp mô dày (3) gồm 3-4 lớp tế bào hình tròn, thành dày. Mô mềm (4) gồm những tế bào hình trứng, thành mỏng, kích thƣớc lớn, không đều nhau, xếp lộn xộn. Nằm rải rác trong mô mềm có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (11). Bó libe-gỗ hình cung nằm giữa gân lá, libe (9) xếp thành vòng bao quanh gỗ, gỗ (10) cấu tạo bởi những mạch gỗ lớn xếp tập trung thành bó. Bao quanh bó libe gỗ có các ống tiết chất nhày (12).
Phần phiến lá: Biểu bì trên (5) và biểu bì dƣới (8) gồm một hàng tế bào
hình chữa nhật xếp đều đặn. Mô giậu (6) cấu tạo bởi một lớp tế bào hình chữ
nhật xếp thẳng đứng vuông góc với bề mặt lá. Mô khuyết gồm những tế bào
thành mỏng, xếp lộn xộn (7).
Hình 3.11. Vi phẫu lá Đơn châu chấu Ghi chú:
Gân lá Phiến lá
1. Gai 5. Biểu bì trên 2. Biểu bì trên 6. Mô giậu 3. Mô dày 7. Mô khuyết 4. Mô mềm 8. Biểu bì dƣới 9. Libe
10. Gỗ
11. Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai 12. Ống tiết chất nhày
13. Biểu bì dƣới
3.1.2.2. Đặc điểm vi phẫu thân
Mặt cắt thân hình tròn, từ ngoài vào trong có: biểu bì (1) gồm một hàng tế bào đều đặn, thƣờng mang gai (11). Xếp sát biểu bì là mô dày gồm 4- 5 lớp tế bào hình tròn, kích thƣớc không đều, thành dày (2). Mô mềm vỏ (3) cấu tạo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
bởi vài lớp tế bào hình trứng, thành mỏng, kích thƣớc không đều nhau, sắp xếp lộn xộn. Nằm rải rác trong mô mềm vỏ có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (5) và các ống tiết chất nhày (4). Sát libe là các đám tế bào thành dày hóa gỗ (6). Libe cấu tạo từ các tế bào nhỏ, tập trung thành từng bó (7). Tầng phát sinh libe- gỗ (8). Bó gỗ gồm những mạch gỗ lớn (9), xếp thành hàng, tập trung thành bó. Các bó libe-gỗ kích thƣớc to nhỏ không đều nhau. Phía trong cùng là mô mềm ruột (10).
Ảnh chụp vi phẫu thân cây Đơn châu chấu đƣợc trình bày ở hình 3.12.
10
Hình 3.12. Vi phẫu thân cây Đơn châu chấu
Chú thích:
1. Biểu bì 2. Mô dày 3. Mô mềm vỏ 4. Ống tiết chất nhày
5. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
6. Đám tế bào thành dày hóa gỗ 7. Libe 8. Tầng phát sinh libe – gỗ 9. Gỗ 10. Mô mềm ruột 11. Gai 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9
(a) (b)
Hình 3.13. Tinh thể calci oxalat trong mô mềm vỏ của thân khi quan sát ở vật kính 40 (a), và vi phẫu gai Đơn châu chấu (b)
3.1.2.3. Đặc điểm vi phẫu rễ
Mặt cắt ngang hình tròn. Từ ngoài vào trong có: lớp bần (1) gồm 4 - 6 hàng tế bào hình chữ nhật, xếp đều đặn thành vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm. Mô mềm vỏ (2) cấu tạo từ những tế bào thành mỏng, phần ngoài thƣờng bị ép bẹt. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai nằm rải rác trong mô mềm vỏ và libe, có thể đứng riêng lẻ hoặc tập trung thành đám (3). Các tế bào libe nhỏ, xếp xít nhau thành bó (4). Tầng phát sinh libe gỗ (5). Mô gỗ gồm các mạch gỗ kích thƣớc không đều nhau, các bó gỗ xuất phát từ tâm (6).
Ảnh chụp vi phẫu rễ cây Đơn châu chấu đƣợc trình bày ở hình 3.14.
Hình 3.14. Vi phẫu rễ cây Đơn châu chấu
11 5 Ghi chú: 1. Bần 2. Mô mềm vỏ 3. Đám tinh thể calci oxalat hình cầu gai 4. Libe 5. Tầng phát sinh libe- gỗ 6. Gỗ 1 2 3 4 5 6
3.1.3. Đặc điểm bột dƣợc liệu
3.1.3.1. Đặc điểm bột lá Đơn châu chấu
Bột dƣợc liệu màu xanh xám, mùi hắc, vị chát.
Quan sát dƣới kính hiển vi thấy: Mảnh phiến lá mang mạch dẫn (1),
mang tinh thể calci oxalat hình cầu gai (4) và mang mô giậu (2). Nhiều mảnh
biểu bì mang lỗ khí (3). Rải rác có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai, tụ tập
thành đám hoặc đứng riêng rẽ (8). Mảnh mạch xoắn (6), gai (5).
Ảnh chụp các đặc điểm bột lá Đơn châu chấu dƣới kính hiển vi đƣợc
