2.7.3.1 Định nghĩa
IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 được định nghĩa là nồng độ (mg/mL) của mẫu tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.
2.7.3.2 Cách xác định IC50
Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau.
Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta vẽ một đường thẳng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là % ức chế và x là nồng độ).
Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần đúng, chúng ta chọn hai nồng độ ức chế trên và dưới 50% và cũng tiến hành vẽ đường thẳng y = ax + b. Ta sẽ thu được phương trình y = ax + b với hệ số a, b đã biết.
Thay y = 50% vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x, đó chính là nồng độ ức chế được 50% gốc tự do (IC50).
24
CHƯƠNG 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện
3.1.1 Địa điểm và thời gian
Đề tài luận văn ‟Khảo sát thành phần hóa học của loài địa y Dirinaria
applanata (Fée) D. D. Awasthi” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa
Sinh 1, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ. Đề tài được thực hiện từ tháng 08/2013 đến tháng 11/2013.
3.1.2 Thu hái mẫu cây
Mẫu cây được thu vào 12/2012 tại khuôn viên trường Đại học Cần Thơ, thành phố Cần Thơ. Mẫu cây được định danh là Dirinaria Applanta (Fée) D.
D. Awasthi do ThS. Nguyễn Thị Kim Huê – bộ môn Sinh học, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ. Mẫu cây hiện được lưu giữ tại phòng thí nghiệm Hóa Sinh 1, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.3 Dụng cụ
Máy quang phổ hồng ngoại FT – IR Nicolet 6700.
Máy UV – Vis Jenway 6800.
Tủ sấy, tủ hút.
Máy cô quay chân không.
Máy soi UV.
Cột sắc ký.
Cân phân tích Sartorius bốn số lẻ.
Một số dụng cụ khác như: phễu chiết, bếp điện, erlen, becher, bình chiết, đũa thủy tinh, ống vi quản,…
3.1.4 Hóa chất
Các dung môi: petroleum ether, ethyl acetate, chloroform, acetone, methanol….
Silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm).
Bản mỏng tráng sẵn (Merck).
Na2SO4 dùng để làm khan dung môi.
25
3.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ cao chiết
Để phát hiện, phân lập được những hợp chất tinh khiết từ các loại cao chiết, những phương pháp phân lập được sử dụng gồm:
Phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Phương pháp sắc ký cột.
Phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế.
Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại.
3.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất chất
Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, Rf, điểm nóng chảy,... khi phân lập được hợp chất tinh khiết sẽ tiến hành ghi phổ hồng ngoại (FT–IR), nhằm xác định nhóm chức đặc trưng của những hợp chất phân lập được.
3.4 Điều chế các loại cao 3.4.1 Xử lý mẫu 3.4.1 Xử lý mẫu
Mẫu sau khi thu hái tại địa điểm trên, để khô tại nhiệt độ phòng. Sau đó được nghiền mịn, cho mẫu vào túi vải, buộc kỹ và đặt vào lọ thủy tinh dung tích 10 L.
3.4.2 Điều chế cao methanol tổng
Cao methanol tổng được điều chế bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm [24]. Tổng cộng quá trình chiết đã sử dụng hết 20 L methanol. Khối lượng bột cây đem ngâm là 1,28 kg. Đem dịch chiết cô quay thu hồi dung môi thu được cao tổng. Khối lượng cao methanol tổng là 210 g.
Hiệu suất điều chế cao methanol tổng:
H = 210
26
3.4.3 Điều chế các loại cao chiết
Các loại cao chiết dùng cho quá trình khảo sát được điều chế bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng [24].
3.4.3.1 Điều chế cao petroleum ether
Từ cao methanol tổng pha với nước cất lọc qua giấy lọc để loại cặn. Dịch cao methanol tổng được chiết lỏng – lỏng với petroleum ether lấy phần trên (trích nhiều lần bằng bình chiết, cho tới lúc phần lớp trên không còn màu thì ngưng). Lấy phần dung dịch lớp trên đem cô quay thu được cao petroleum ether, khối lượng cao là 88 g.
Hiệu suất điều chế cao petroleum ether: H = 88
210 × 100 = 41,90 %
3.4.3.2 Điều chế cao ethyl acetate
Phần lớp dưới khi trích với petroleum ether sẽ được đem chiết với dung môi ethyl acetate bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng. Khi chiết với ethyl acetate ta thu lớp trên chính là dịch chiết của ethyl acetate. Chiết tới lớp trên không còn màu nữa thì ngưng. Cô quay, thu hồi dung môi được cao ethyl acetate, khối lượng là 76 g.
Hiệu suất điều chế cao ethyl acetate:
H = 76
210 × 100 = 36,19 %
3.4.3.3 Điều chế cao nước
Phần lớp dưới sau khi chiết với ethyl acetate đem cô quay lại, thu được cao nước. Khối lượng cao là 46 g.
Hiệu suất điều chế cao nước:
H = 46
210 × 100 = 21,9 %
Từ nguyên liệu đã thu hái, tiến hành điều chế cao petroleum ether, cao ethyl acetate và cao nước. Quy trình điều chế cao được trình bày ở Hình 3.1.
27
Hình 3.1: Quy trình điều chế các loại cao
3.5 Khảo sát cao ethyl acetate 3.5.1 Sắc ký cột cao ethyl acetate 3.5.1 Sắc ký cột cao ethyl acetate
Trước hết, sử dụng sắc ký lớp mỏng dò tìm hệ dung môi để bắt đầu và chấm dứt quá trình sắc ký cột. Với dung môi chloroform (100%) bản mỏng cho các vết chính tròn, đẹp trên bản mỏng và Rf không quá cao, vì vậy chloroform (100%) được chọn làm dung môi giải ly đầu tiên để tiến hành sắc ký cột.
Kết quả khảo sát sơ bộ cao ethyl acetate bằng SKLM được trình bày ở Hình 3.2.
Cao nước (46 g) Cao ethyl acetate
(76 g)
Phần dịch còn lại Cao petroleum ether
(88 g)
Cao methanol (210 g) Bột cây (1,28 kg)
Chiết kiệt với methanol Cô quay, thu hồi dung môi
Thêm nước vừa đủ để hòa tan Lắc với petroleum ether Cô quay, thu hồi dung môi
Lắc với ethyl acetate Cô quay, thu hồi dung môi
28
A b
a b
Hình 3.2: SKLM khảo sát cao ethyl acetate a. Hiện hình mỏng dưới đèn UV λ = 254 nm b. Hiện hình bản mỏng trong dung dịch vanillin Dung môi giải ly bản là chloroform (100%).
Nhận xét: từ Hình 3.2 cho thấy, cao ethyl acetate có chứa các hợp chất
có tính phân cực trung bình và khá cho các vết chính rõ đẹp.
Tiến hành SKC trên cao ethyl acetate (76 g), pha tĩnh là silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm), m = 320, Φ = 4,5 cm, l = 58 cm. Dung môi giải ly ban đầu là chloroform (100%) và tăng dần độ phân cực của dung môi. Dung dịch ra khỏi cột được hứng lại bằng các bình chứa có thể tích bằng nhau. Theo dõi quá trình SKC bằng SKLM và gom các bình có SKLM giống nhau. Tổng cộng thu được 9 phân đoạn.
Kết quả SKC trên cao ethyl acetate được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1: Kết quả SKC trên cao ethyl acetate
STT Ký hiệu phân đoạn
Dung môi giải ly cột SKLM Khối lượng (g) 1 – 3 E1 Chloroform SKLM cho 1 vết vàng. Không khảo sát. 2,07 4 E2 // SKLM cho 5 vết kéo dài. Không khảo sát. 8,63 5 – 7 E3 // SKLM cho 1 vết tím, 1 vết đỏ, 2 vết hồng. 5,44
29 Tiến hành khảo sát. 8 – 14 E4 // SKLM cho 4 vết kéo dài. Không khảo sát. 4,78 15 – 17 E5 // SKLM cho 1 vết tím kéo dài, 1 vết hồng nhạt. Không khảo sát. 3,26 18 – 33 E6 // SKLM cho 1 vết tím kéo dài, 2 vết hồng. Không khảo sát. 5,27 34 – 63 E7 // SKLM cho 1 vết chính màu hồng, 1 vết hồng. Tiến hành khảo sát 9,16 64 – 71 E8 // SKLM cho 1 vết xanh tím và 1 vết hồng. Tiến hành khảo sát 10,52 72 – 77 E9 Chloroform:MeOH (95:5) SKLM cho 1 vệt nâu kéo dài. Không khảo sát
5,12
78 – 95 Xả cột MeOH Không khảo sát 15,13
Tổng khối lượng thu được của các phân đoạn 69,43
Nhận xét: Sắc ký cột cao ethyl acetate thu được tổng cộng 9 phân đọan,
các phân đoạn có vết đặc trưng và rõ ràng được chọn để tiếp tục khảo sát:
Phân đoạn E3 (5 – 7)
Phân đoạn E7 (34 – 63)
30
3.5.2 Khảo sát phân đoạn E3
Phân đoạn E3 thu được từ lọ 5 – 7 sau khi SKC cao ethyl acetate, có khối lượng là 5,4442 g. SKLM phân đoạn E3 với dung môi giải ly PE:Chloroform (50:50) nhận thấy có các vết chính như sau: 1 vết màu tím, 1 vết màu đỏ và 2 vết màu hồng.
3.5.2.1 Xử lý chất rắn màu trắng vô định hình
Quan sát thấy trong phân đoạn E3 sau khi để bay hơi tự nhiên có xuất hiện chất rắn màu trắng, tan kém trong các loại dung môi có độ phân cực thấp, trung bình và cao.
Tiến hành lọc nóng hợp chất này 3 lần với chloroform để loại bỏ tạp chất. Nhận thấy hợp chất màu trắng này tan rất kém trong các loại dung môi. Vì vậy, dùng methanol để loại bỏ những hợp chất có độ phân cực từ thấp đến cao thu được chất rắn vô định hình màu trắng có khối lượng là 1,0215 g. Tạm gọi hợp chất thu được là HP9.
Sắc ký lớp mỏng hợp chất HP9 với các hệ dung môi giải ly là PE:Chloroform:MeOH (50:50:5); chloroform:MeOH (95:5); chloroform:MeOH (90:10) để khảo sát mức độ tinh khiết. Kết quả SKLM được trình bày ở Hình 3.3.
Hình 3.3: SKLM khảo sát hợp chất HP9
Dung môi giải ly bản 1, 2 và 3 lần lượt là PE:Chloroform:MeOH (50:50:5), chloroform:MeOH (95:5), chloroform:MeOH (90:10).
Giải ly với PE:Chloroform:MeOH (50:50:5) có Rf = 0,21 Giải ly với chloroform:MeOH (95:5) có Rf = 0,51
31
Nhận xét: Với 3 hệ dung môi giải ly có độ phân cực khác nhau, SKLM
hợp chất HP9 thu được từ phân đoạn E3 chỉ cho một vết tròn màu tím. Vậy hợp chất HP9 là một hợp chất tinh khiết.
3.5.2.2 SKC phân đoạn E3 còn lại
Sau khi phân lập được hợp chất HP9, phần còn lại của phân đoạn E3 được để bay hơi tự nhiên.
Tiến hành SKC phân đoạn E3 còn lại (4,41 g), pha tĩnh silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm), m = 52 g, Φ = 3 cm, l = 27 cm. Dung môi giải ly ban đầu là PE:Chloroform (70:30) và tăng dần độ phân cực của dung môi. Dung dịch ra khỏi cột được hứng lại bằng các bình chứa có thể tích bằng nhau. Theo dõi quá trình SKC bằng SKLM và gom các bình có SKLM giống nhau. Tổng cộng thu được 3 phân đoạn.
Kết quả SKC phân đoạn E3 được trình bày ở Bảng 3.2. Bảng 3.2: Kết quả SKC phân đoạn E3
STT Ký hiệu phân đoạn
Dung môi giải ly cột SKLM Khối lượng (g) 1–10 E3.1 PE:Chloroform (70:30) SKLM cho 1 vết chính chỉ hấp thu UV 254 nm. Tiến hành khảo sát. 0,89 11–24 E3.2 PE:Chloroform (70:30) SKLM cho 2 vết chính, màu hồng. Tiến hành khảo sát. 1,27
25–37 E3.3 // SKLM cho vết kéo
dài.
Không khảo sát
1,02
38–50 Xả cột MeOH 100% Không khảo sát 1,14 Tổng khối lượng thu được của các phân đoạn 4,32
Nhận xét: SKC phân đoạn E3 thu được các phân đoạn: E3.1, E3.2, E3.3.
Trong đó, phân đoạn E3.1 và E3.2 cho vết chính tròn, đẹp nên được lựa chọn tiến hành khảo sát tiếp.
32
3.5.2.3 Kết tinh lại phân đoạn E3.1
Phân đoạn E3.1 sau khi để bay hơi tự nhiên thấy xuất hiện chất rắn, màu trắng vàng. Tiến hành lọc và rửa chất rắn này nhiều lần với dung PE:chloroform (70:30) và kết tinh sản phẩm lại trong dung môi chloroform thu được một chất rắn, màu trắng với khối lượng là 0,0234 g. Tạm gọi hợp chất thu được là HP11.
SKLM hợp chất HP11 với các hệ dung môi giải ly PE:Chloroform (50:50), chloroform (100%), chloroform:MeOH (90:10) để khảo sát mức độ tinh khiết. Kết quả SKLM được trình bày ở Hình 3.4.
Hình 3.4: SKLM khảo sát hợp chất HP11
Dung môi giải ly bản 4, 5 và 6 lần lượt là PE:Chloroform (50:50); chloroform (100%); chloroform:MeOH (90:10).
Giải ly với PE:Chloroform (50:50) có Rf = 0,21 Giải ly với chloroform (100%) có Rf = 0,50
Giải ly với chloroform:MeOH (90:10) có Rf = 0,75
Nhận xét: Với 3 hệ dung môi giải ly có độ phân cực khác nhau, SKLM
hợp chất HP11 thu được từ phân đoạn E3 chỉ cho một vết tròn. Hiện hình dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm. Vậy hợp chất HP11 là một hợp chất tinh khiết.
33
3.5.2.4 SKLM điều chế phân đoạn E3.2
Phân đoạn E3.2 sau khi để bay hơi tự nhiên quan sát thấy trong phân đoạn xuất hiện tinh thể hình kim, màu vàng. Tiến hành SKLM với hệ dung môi PE:EA (70:30) nhận thấy 3 vết chính có Rf cách xa nhau rõ rệt. Kết quả SKLM được trình bày ở Hình 3.5.
Hình 3.5: SKLM phân đoạn E3.2
Thực hiện SKLM điều chế phân đoạn E3.2, cạo lấy vết ở giữa thu được tinh thể hình kim màu vàng với khối lượng 0,0417 g. Tạm gọi hợp chất thu được là HP10.
SKLM hợp chất HP10 với các hệ dung môi giải ly chloroform (100%), PE:EA (70:30), chloroform:MeOH (90:10) để khảo sát mức độ tinh khiết. Kết quả SKLM được trình bày ở Hình 3.6.
v
34
Dung môi giải ly bản 7, 8 và 9 lần lượt là chloroform (100%); PE:EA (70:30); chloroform:MeOH (90:10).
Giải ly với chloroform (100%) có Rf = 0,29 Giải ly với PE:EA (70:30) có Rf = 0,48
Giải ly với chloroform:MeOH (90:10) có Rf = 0,70
Nhận xét: Với 3 hệ dung môi giải ly có độ phân cực khác nhau, SKLM
hợp chất HP10 thu được từ phân đoạn E3 chỉ cho một vết tròn, màu đỏ. Vậy hợp chất HP10 là một hợp chất tinh khiết.
3.5.3 Khảo sát phân đoạn E7
Tiến hành SKC phân đoạn E7 (9,1653 g), pha tĩnh silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm), m = 55 g, Φ = 3 cm, l = 28 cm. Dung môi giải ly ban đầu là chloroform (100%) và tăng dần độ phân cực của dung môi. Dung dịch ra khỏi cột được hứng lại bằng các bình chứa có thể tích bằng nhau. Theo dõi quá trình SKC bằng SKLM và gom các bình có SKLM giống nhau. Tổng cộng thu được 3 phân đoạn.
Kết quả SKC phân đoạn E7 được trình bày ở Bảng 3.3. Bảng 3.3: Kết quả SKC phân đoạn E7
STT Ký hiệu phân đoạn Dung môi giải ly cột SKLM Khối lượng (g)
1 – 7 E7.1 Chloroform SKLM cho 1 vệt nâu nhạt kéo dài. Không khảo sát. 2,54 8 – 38 E7.2 // SKLM cho 1 vết vàng, 1 vết hồng nhạt. Không khảo sát. 4,06 39 – 47 E7.3 // SKLM cho 1 vết chính màu hồng, phía dưới 1 vệt kéo dài. Tiến hành khảo sát. 1,02 48 – 68 Xả cột MeOH 100% Không khảo sát 0,70
35
Nhận xét: SKC phân đoạn E7 thu được các phân đoạn là E7.1, E7.2 và
E7.3. Trong đó, phân đoạn E7.3 cho vết chính tròn, có vệt kéo dài được chọn khảo sát tiếp.
3.5.3.1 SKC phân đoạn E7.3
Tiến hành SKC phân đoạn E7.3 (1,0223g), pha tĩnh silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm), m = 25 g, Φ = 2 cm, l = 18 cm. Dung môi giải ly ban đầu là PE:Chloroform (80:20) và tăng dần độ phân cực của dung môi. Dung dịch ra khỏi cột được hứng lại bằng các hũ bi 10mL. Theo dõi quá trình SKC bằng SKLM và gom các hũ bi có SKLM giống nhau. Kết quả thu được 2 phân đoạn.
Kết quả SKC phân đoạn E7.3 được trình bài ở Bảng 3.4. Bảng 3.4: Kết quả SKC phân đoạn E7.3
STT Ký hiệu phân đoạn
Dung môi giải ly cột SKLM Khối lượng (g) 1 – 16 E7.3.1 PE:Chloroform (80:20) SKLM cho 1 vết chính, tròn, màu hồng. Tiến hành khảo sát. 0,41 17 – 74 E7.3.2 PE:Chloroform (70:30) SKLM cho 1 vết hồng, 1 vết tím. Có tạp bẩn. Không khảo sát. 0,25
74 – 84 Xả cột MeOH 100% Không khảo sát 0,17 Tổng khối lượng thu được của các phân đoạn 0,83
Nhận xét: SKC phân đoạn E7.3 thu được các phân đoạn là E7.3.1 và E7.3.2. Trong đó, phân đoạn E7.3.1 cho một vết chính tròn được chọn để khảo sát tiếp.
3.5.3.2 SKC phân đoạn E7.3.1
Tiến hành SKC phân đoạn E7.3.1 (0,41g), pha tĩnh silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm), m = 20 g, Φ = 2 cm, l = 16 cm. Dung môi giải ly ban