Sắc ký cột hấp phụ được tiến hành trên một cột thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột là pha động chảy qua chất hấp phụ.
Đây là một trong những kỹ thuật nhằm phân đoạn cao thô ban đầu ra thành các phân đoạn cao nhỏ hơn, có độ phân cực khác nhau, hoặc cô lập ra hợp chất tinh khiết từ một phân đoạn cao nhỏ [24].
2.6.2.1 Chuẩn bị cột
Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn trong cột phải phân tán đồng đều ở mỗi điểm trong cột thành một khối đồng nhất.
Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch).
21
2.6.2.2 Cho chất hấp phụ vào cột
Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay đổi thông thường từ 1/20, 1/30, 1/50, 1/100,…
Tỷ lệ =Trọng lượng chất phân tích
Trọng lượng chất hấp phụ Có hai cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô.
Nhồi cột ướt: dùng cho các chất hấp phụ có khả năng trương phình như silica gel, sephadex,…
Nhồi cột khô: dùng cho các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như Al2O3, CaCO3,…
2.6.2.3 Đưa chất phân tích vào cột
Yêu cầu việc đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán chất thử thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều phương pháp đưa chất phân tích vào cột như:
Cho thẳng dung dịch thử lên cột: hòa tan chất phân tích vào một lượng vừa đủ dung môi (càng ít càng tốt).
Trộn chất thử với một lượng chất hấp phụ: trộn dung dịch chất phân tích với một lượng nhỏ chất hấp phụ cho thật đều, sấy khô rồi cho vào cột bằng cách rải thành một lớp đều đặn trên mặt cột.
Trong hai phương pháp trên, phương pháp cho thẳng dung dịch vào cột là gọn và nhanh hơn cả, nhưng phải đảm bảo các yêu cầu kỹ thuật sau:
Chất thử hòa tan hoàn toàn.
Dung dịch chất thử phải nạp vào cột đều.
Khi toàn bộ chất thử ngấm hết vào cột, mới cho tiếp dung môi mới.
2.6.2.4 Giải ly cột
Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà người ta có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc bằng áp suất nén:
- Giải ly cột bằng áp suất thường: có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ có kích thước hạt lớn.
- Giải ly cột bằng áp suất nén: người ta thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen hoặc không khí) vào đầu cột.
22
Ở sắc ký cột cổ điển, dung môi rửa cột được dùng với độ phân cực tăng dần. Dung môi phải tinh khiết, vì những tạp chất lẫn vào dung môi thường làm thay đổi độ phân cực của dung môi đó, vì thế người ta thường chưng cất dung môi trước khi sử dụng.
Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển từ từ bằng cách pha tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần. Nếu tăng tính phân cực nhanh và đột ngột có thể làm gãy cột.
Trên thực tế nhiều khi dùng những dung môi thông thường không tách được nên người ta thường dùng hỗn hợp nhiều dung môi.
2.6.2.5 Theo dõi quá trình giải ly cột
Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được theo dõi bằng mắt thường. Tuy nhiên, đa số hợp chất hữu cơ tự nhiên đều không có màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột thường bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Thường trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo để chọn chất hấp phụ và dung môi. Tiến hành thăm dò bằng sắc ký lớp mỏng để tìm ra hệ dung môi tách tốt nhất.