3.5.1 Sắc ký cột cao ethyl acetate
Trước hết, sử dụng sắc ký lớp mỏng dò tìm hệ dung môi để bắt đầu và chấm dứt quá trình sắc ký cột. Với dung môi chloroform (100%) bản mỏng cho các vết chính tròn, đẹp trên bản mỏng và Rf không quá cao, vì vậy chloroform (100%) được chọn làm dung môi giải ly đầu tiên để tiến hành sắc ký cột.
Kết quả khảo sát sơ bộ cao ethyl acetate bằng SKLM được trình bày ở Hình 3.2.
Cao nước (46 g) Cao ethyl acetate
(76 g)
Phần dịch còn lại Cao petroleum ether
(88 g)
Cao methanol (210 g) Bột cây (1,28 kg)
Chiết kiệt với methanol Cô quay, thu hồi dung môi
Thêm nước vừa đủ để hòa tan Lắc với petroleum ether Cô quay, thu hồi dung môi
Lắc với ethyl acetate Cô quay, thu hồi dung môi
28
A b
a b
Hình 3.2: SKLM khảo sát cao ethyl acetate a. Hiện hình mỏng dưới đèn UV λ = 254 nm b. Hiện hình bản mỏng trong dung dịch vanillin Dung môi giải ly bản là chloroform (100%).
Nhận xét: từ Hình 3.2 cho thấy, cao ethyl acetate có chứa các hợp chất
có tính phân cực trung bình và khá cho các vết chính rõ đẹp.
Tiến hành SKC trên cao ethyl acetate (76 g), pha tĩnh là silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm), m = 320, Φ = 4,5 cm, l = 58 cm. Dung môi giải ly ban đầu là chloroform (100%) và tăng dần độ phân cực của dung môi. Dung dịch ra khỏi cột được hứng lại bằng các bình chứa có thể tích bằng nhau. Theo dõi quá trình SKC bằng SKLM và gom các bình có SKLM giống nhau. Tổng cộng thu được 9 phân đoạn.
Kết quả SKC trên cao ethyl acetate được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1: Kết quả SKC trên cao ethyl acetate
STT Ký hiệu phân đoạn
Dung môi giải ly cột SKLM Khối lượng (g) 1 – 3 E1 Chloroform SKLM cho 1 vết vàng. Không khảo sát. 2,07 4 E2 // SKLM cho 5 vết kéo dài. Không khảo sát. 8,63 5 – 7 E3 // SKLM cho 1 vết tím, 1 vết đỏ, 2 vết hồng. 5,44
29 Tiến hành khảo sát. 8 – 14 E4 // SKLM cho 4 vết kéo dài. Không khảo sát. 4,78 15 – 17 E5 // SKLM cho 1 vết tím kéo dài, 1 vết hồng nhạt. Không khảo sát. 3,26 18 – 33 E6 // SKLM cho 1 vết tím kéo dài, 2 vết hồng. Không khảo sát. 5,27 34 – 63 E7 // SKLM cho 1 vết chính màu hồng, 1 vết hồng. Tiến hành khảo sát 9,16 64 – 71 E8 // SKLM cho 1 vết xanh tím và 1 vết hồng. Tiến hành khảo sát 10,52 72 – 77 E9 Chloroform:MeOH (95:5) SKLM cho 1 vệt nâu kéo dài. Không khảo sát
5,12
78 – 95 Xả cột MeOH Không khảo sát 15,13
Tổng khối lượng thu được của các phân đoạn 69,43
Nhận xét: Sắc ký cột cao ethyl acetate thu được tổng cộng 9 phân đọan,
các phân đoạn có vết đặc trưng và rõ ràng được chọn để tiếp tục khảo sát:
Phân đoạn E3 (5 – 7)
Phân đoạn E7 (34 – 63)
30
3.5.2 Khảo sát phân đoạn E3
Phân đoạn E3 thu được từ lọ 5 – 7 sau khi SKC cao ethyl acetate, có khối lượng là 5,4442 g. SKLM phân đoạn E3 với dung môi giải ly PE:Chloroform (50:50) nhận thấy có các vết chính như sau: 1 vết màu tím, 1 vết màu đỏ và 2 vết màu hồng.
3.5.2.1 Xử lý chất rắn màu trắng vô định hình
Quan sát thấy trong phân đoạn E3 sau khi để bay hơi tự nhiên có xuất hiện chất rắn màu trắng, tan kém trong các loại dung môi có độ phân cực thấp, trung bình và cao.
Tiến hành lọc nóng hợp chất này 3 lần với chloroform để loại bỏ tạp chất. Nhận thấy hợp chất màu trắng này tan rất kém trong các loại dung môi. Vì vậy, dùng methanol để loại bỏ những hợp chất có độ phân cực từ thấp đến cao thu được chất rắn vô định hình màu trắng có khối lượng là 1,0215 g. Tạm gọi hợp chất thu được là HP9.
Sắc ký lớp mỏng hợp chất HP9 với các hệ dung môi giải ly là PE:Chloroform:MeOH (50:50:5); chloroform:MeOH (95:5); chloroform:MeOH (90:10) để khảo sát mức độ tinh khiết. Kết quả SKLM được trình bày ở Hình 3.3.
Hình 3.3: SKLM khảo sát hợp chất HP9
Dung môi giải ly bản 1, 2 và 3 lần lượt là PE:Chloroform:MeOH (50:50:5), chloroform:MeOH (95:5), chloroform:MeOH (90:10).
Giải ly với PE:Chloroform:MeOH (50:50:5) có Rf = 0,21 Giải ly với chloroform:MeOH (95:5) có Rf = 0,51
31
Nhận xét: Với 3 hệ dung môi giải ly có độ phân cực khác nhau, SKLM
hợp chất HP9 thu được từ phân đoạn E3 chỉ cho một vết tròn màu tím. Vậy hợp chất HP9 là một hợp chất tinh khiết.
3.5.2.2 SKC phân đoạn E3 còn lại
Sau khi phân lập được hợp chất HP9, phần còn lại của phân đoạn E3 được để bay hơi tự nhiên.
Tiến hành SKC phân đoạn E3 còn lại (4,41 g), pha tĩnh silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm), m = 52 g, Φ = 3 cm, l = 27 cm. Dung môi giải ly ban đầu là PE:Chloroform (70:30) và tăng dần độ phân cực của dung môi. Dung dịch ra khỏi cột được hứng lại bằng các bình chứa có thể tích bằng nhau. Theo dõi quá trình SKC bằng SKLM và gom các bình có SKLM giống nhau. Tổng cộng thu được 3 phân đoạn.
Kết quả SKC phân đoạn E3 được trình bày ở Bảng 3.2. Bảng 3.2: Kết quả SKC phân đoạn E3
STT Ký hiệu phân đoạn
Dung môi giải ly cột SKLM Khối lượng (g) 1–10 E3.1 PE:Chloroform (70:30) SKLM cho 1 vết chính chỉ hấp thu UV 254 nm. Tiến hành khảo sát. 0,89 11–24 E3.2 PE:Chloroform (70:30) SKLM cho 2 vết chính, màu hồng. Tiến hành khảo sát. 1,27
25–37 E3.3 // SKLM cho vết kéo
dài.
Không khảo sát
1,02
38–50 Xả cột MeOH 100% Không khảo sát 1,14 Tổng khối lượng thu được của các phân đoạn 4,32
Nhận xét: SKC phân đoạn E3 thu được các phân đoạn: E3.1, E3.2, E3.3.
Trong đó, phân đoạn E3.1 và E3.2 cho vết chính tròn, đẹp nên được lựa chọn tiến hành khảo sát tiếp.
32
3.5.2.3 Kết tinh lại phân đoạn E3.1
Phân đoạn E3.1 sau khi để bay hơi tự nhiên thấy xuất hiện chất rắn, màu trắng vàng. Tiến hành lọc và rửa chất rắn này nhiều lần với dung PE:chloroform (70:30) và kết tinh sản phẩm lại trong dung môi chloroform thu được một chất rắn, màu trắng với khối lượng là 0,0234 g. Tạm gọi hợp chất thu được là HP11.
SKLM hợp chất HP11 với các hệ dung môi giải ly PE:Chloroform (50:50), chloroform (100%), chloroform:MeOH (90:10) để khảo sát mức độ tinh khiết. Kết quả SKLM được trình bày ở Hình 3.4.
Hình 3.4: SKLM khảo sát hợp chất HP11
Dung môi giải ly bản 4, 5 và 6 lần lượt là PE:Chloroform (50:50); chloroform (100%); chloroform:MeOH (90:10).
Giải ly với PE:Chloroform (50:50) có Rf = 0,21 Giải ly với chloroform (100%) có Rf = 0,50
Giải ly với chloroform:MeOH (90:10) có Rf = 0,75
Nhận xét: Với 3 hệ dung môi giải ly có độ phân cực khác nhau, SKLM
hợp chất HP11 thu được từ phân đoạn E3 chỉ cho một vết tròn. Hiện hình dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm. Vậy hợp chất HP11 là một hợp chất tinh khiết.
33
3.5.2.4 SKLM điều chế phân đoạn E3.2
Phân đoạn E3.2 sau khi để bay hơi tự nhiên quan sát thấy trong phân đoạn xuất hiện tinh thể hình kim, màu vàng. Tiến hành SKLM với hệ dung môi PE:EA (70:30) nhận thấy 3 vết chính có Rf cách xa nhau rõ rệt. Kết quả SKLM được trình bày ở Hình 3.5.
Hình 3.5: SKLM phân đoạn E3.2
Thực hiện SKLM điều chế phân đoạn E3.2, cạo lấy vết ở giữa thu được tinh thể hình kim màu vàng với khối lượng 0,0417 g. Tạm gọi hợp chất thu được là HP10.
SKLM hợp chất HP10 với các hệ dung môi giải ly chloroform (100%), PE:EA (70:30), chloroform:MeOH (90:10) để khảo sát mức độ tinh khiết. Kết quả SKLM được trình bày ở Hình 3.6.
v
34
Dung môi giải ly bản 7, 8 và 9 lần lượt là chloroform (100%); PE:EA (70:30); chloroform:MeOH (90:10).
Giải ly với chloroform (100%) có Rf = 0,29 Giải ly với PE:EA (70:30) có Rf = 0,48
Giải ly với chloroform:MeOH (90:10) có Rf = 0,70
Nhận xét: Với 3 hệ dung môi giải ly có độ phân cực khác nhau, SKLM
hợp chất HP10 thu được từ phân đoạn E3 chỉ cho một vết tròn, màu đỏ. Vậy hợp chất HP10 là một hợp chất tinh khiết.
3.5.3 Khảo sát phân đoạn E7
Tiến hành SKC phân đoạn E7 (9,1653 g), pha tĩnh silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm), m = 55 g, Φ = 3 cm, l = 28 cm. Dung môi giải ly ban đầu là chloroform (100%) và tăng dần độ phân cực của dung môi. Dung dịch ra khỏi cột được hứng lại bằng các bình chứa có thể tích bằng nhau. Theo dõi quá trình SKC bằng SKLM và gom các bình có SKLM giống nhau. Tổng cộng thu được 3 phân đoạn.
Kết quả SKC phân đoạn E7 được trình bày ở Bảng 3.3. Bảng 3.3: Kết quả SKC phân đoạn E7
STT Ký hiệu phân đoạn Dung môi giải ly cột SKLM Khối lượng (g)
1 – 7 E7.1 Chloroform SKLM cho 1 vệt nâu nhạt kéo dài. Không khảo sát. 2,54 8 – 38 E7.2 // SKLM cho 1 vết vàng, 1 vết hồng nhạt. Không khảo sát. 4,06 39 – 47 E7.3 // SKLM cho 1 vết chính màu hồng, phía dưới 1 vệt kéo dài. Tiến hành khảo sát. 1,02 48 – 68 Xả cột MeOH 100% Không khảo sát 0,70
35
Nhận xét: SKC phân đoạn E7 thu được các phân đoạn là E7.1, E7.2 và
E7.3. Trong đó, phân đoạn E7.3 cho vết chính tròn, có vệt kéo dài được chọn khảo sát tiếp.
3.5.3.1 SKC phân đoạn E7.3
Tiến hành SKC phân đoạn E7.3 (1,0223g), pha tĩnh silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm), m = 25 g, Φ = 2 cm, l = 18 cm. Dung môi giải ly ban đầu là PE:Chloroform (80:20) và tăng dần độ phân cực của dung môi. Dung dịch ra khỏi cột được hứng lại bằng các hũ bi 10mL. Theo dõi quá trình SKC bằng SKLM và gom các hũ bi có SKLM giống nhau. Kết quả thu được 2 phân đoạn.
Kết quả SKC phân đoạn E7.3 được trình bài ở Bảng 3.4. Bảng 3.4: Kết quả SKC phân đoạn E7.3
STT Ký hiệu phân đoạn
Dung môi giải ly cột SKLM Khối lượng (g) 1 – 16 E7.3.1 PE:Chloroform (80:20) SKLM cho 1 vết chính, tròn, màu hồng. Tiến hành khảo sát. 0,41 17 – 74 E7.3.2 PE:Chloroform (70:30) SKLM cho 1 vết hồng, 1 vết tím. Có tạp bẩn. Không khảo sát. 0,25
74 – 84 Xả cột MeOH 100% Không khảo sát 0,17 Tổng khối lượng thu được của các phân đoạn 0,83
Nhận xét: SKC phân đoạn E7.3 thu được các phân đoạn là E7.3.1 và E7.3.2. Trong đó, phân đoạn E7.3.1 cho một vết chính tròn được chọn để khảo sát tiếp.
3.5.3.2 SKC phân đoạn E7.3.1
Tiến hành SKC phân đoạn E7.3.1 (0,41g), pha tĩnh silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm), m = 20 g, Φ = 2 cm, l = 16 cm. Dung môi giải ly ban đầu là PE:Chloroform (50:50) và tăng dần độ phân cực của dung môi. Dung dịch ra khỏi cột được hứng lại bằng các hũ bi 10mL. Theo dõi quá trình SKC bằng SKLM và gom các hũ bi có SKLM giống nhau. Kết quả thu được 2 phân đoạn.
36 Bảng 3.5: Kết quả SKC phân đoạn E7.3.1
STT Ký hiệu phân đoạn
Dung môi giải ly cột SKLM Khối lượng (g) 1–5 E7.3.1.1 PE:Chloroform (50:50) SKLM cho vết hồng nhạt kéo vệt. Không khảo sát 0,1053 6–22 E7.3.1.2 PE:Chloroform (50:50) SKLM cho 1 vết chính tròn, màu hồng. Tiến hành khảo sát. 0,12
23–40 Xả cột MeOH SKLM cho vết kéo dài.
Không khảo sát.
0,10
Tổng khối lượng thu được của các phân đoạn 0,3253
Nhận xét: SKC phân đoạn E7.3.1 thu được các phân đoạn là E7.3.1.1 và
E7.3.1.2. Trong đó, phân đoạn E7.3.1.2 cho một vết chính tròn được chọn để khảo sát tiếp.
Phân đoạn E7.3.1.2 có dạng dầu, màu vàng nâu, khối lượng 0,1079 g. SKLM phân đoạn E7.3.1.2 cho thấy một vết chính tròn, loang, màu hồng. Tạm gọi hợp chất thu được là HP7.
SKLM hợp chất thu được với các hệ dung môi giải ly: Chloroform:MeOH (95:5); chloroform:MeOH (90:10); EA:AcOH (99:1) để khảo sát mức độ tinh khiết. Kết quả SKLM được trình bày ở Hình 3.7.
37
Dung môi giải ly bản 10, 11 và 12 lần lượt là: Chloroform:MeOH (95:5); chloroform:MeOH (90:10); EA:AcOH (99:1).
Giải ly với chloroform:MeOH (95:5) có Rf = 0,25 Giải ly với chloroform:MeOH (90:10) có Rf = 0,61 Giải ly với EA:AcOH (99:1) có Rf = 0,84
Nhận xét: Với 3 hệ dung môi giải ly có độ phân cực khác nhau. SKLM
hợp chất thu được từ phân đoạn E7.3.1.2 chỉ cho một vết tròn, màu hồng. Vậy hợp chất thu được từ phân đoạn E7.3.1.2 là một hợp chất tinh khiết.
3.5.4 Khảo sát phân đoạn E8
Phân đoạn E8 thu được từ lọ 64 – 71 khi SKC cao ethyl acetate. Phân đoạn E8 có xuất hiện dạng tinh thể hình kim, màu trắng có lẫn hợp chất phân cực và nhựa, khối lượng 10,5247 g. SKLM phân đoạn E8 cho thấy một vết chính màu tím nhưng phía trên và phía dưới vết tím có vệt kéo dài. Phân đoạn này được xử lý bằng cách lọc nóng phần rắn nhiều lần với dung môi ethyl acetate. Sau đó, thực hiện kết tinh lại 5 lần trong methanol. Thu được hợp chất tinh khiết, kết tinh hình kim, màu trắng, khối lượng là 0,523 g. Tạm gọi hợp chất thu được là HP8.
SKLM hợp chất HP8 với các hệ dung môi giải ly là: Chloroform:MeOH (95:5); chloroform:MeOH (90:10); EA:AcOH (99:1). Kết quả SKLM hợp chất HP8 được trình bày ở Hình 3.8.
Hình 3.8: SKLM khảo sát hợp chất HP8
Dung môi giải ly bản 13, 14 và 15 lần lượt là: Chloroform:MeOH (95:5); Chloroform:MeOH (90:10); EA:AcOH (99:1).
Giải ly với chloroform:MeOH (95:5) có Rf = 0,23 Giải ly với chloroform:MeOH (90:10) có Rf = 0,60 Giải ly với EA:AcOH (99:1) có Rf =0,76
38
Nhận xét: với 3 hệ dung môi giải ly có độ phân cực khác nhau. SKLM
hợp chất HP8 thu được từ phân đoạn E8 chỉ cho vết tròn, màu xanh tím. Vậy hợp chất HP8 thu được từ phân đoạn E8 là một hợp chất tinh khiết.
3.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH
3.6.1 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate
Mẫu dịch chiết cao ethyl acetate hàm lượng 1 mg/mL (10 mg cao ethyl acetate trong 10 mL dung môi) được pha loãng 4 lần thì nồng độ là 0,25 mg/mL. Dung dịch này dùng để thử hoạt tính.
Trong đó, vitamin C được dùng làm mẫu đối chứng dương để so sánh với dịch chiết cao ethyl acetate của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi về khả năng kháng oxi hóa.
Quy trình thử hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate bằng DPPH được tóm tắt ở Hình 3.9.
Hình 3.9: Quy trình khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate - 250 µL DPPH(0,05 mg/mL) trong ethanol . - Ủ 30 phút trong bóng tối. V1 µL mẫu. V2 µL ethanol. 250 µL dung dịch mẫu.
Dung dịch sau khi ủ.
39
Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate STT V1 µL dịch chiết EA (0,25 mg/mL) V2 µL ethanol V µL DPPH (0,05 mg/mL) 1 2 3 4 5 6 7 Mẫu trắng (ethanol) 0 50 100 150 200 250 250 250 200 150 100 50 0 0 250 250 250 250 250 250
Lắc đều và ủ 30 phút trong bóng tối ở điều kiện phòng.
Đo ở bước sóng 517 nm.
Bảng 3.7: Kết quả đo OD dịch chiết cao ethyl acetate (λ = 517 nm)
Cao ethyl acetate Mẫu trắng 0 μL 50 μL (0,025 mg/mL) 100 μL (0,05 mg/mL) 150 μL (0,075 mg/mL) 200 μL (0,1 mg/mL) 250 μL (0,125 mg/mL) OD (517 nm) 0,2099 0,1784 0,1432 0,1078 0,0707 0,0535 % 0.0000 18,0086 32,7770 48,6422 66,3173 77,5131
3.6.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của vitamin C
Mẫu dịch chiết vitamin C hàm lượng 1 mg/mL (10 mg vitamin C trong 10 mL dung môi) được pha loãng 4 lần thì nồng độ là 0,25 mg/mL. Dung dịch này dùng để thử hoạt tính.
40
Bảng 3.8: Bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của vitamin C
STT V1 µL dịch chiết vitamin C (0,25 mg/mL) V2 µL ethanol khan V µL DPPH (0,05 mg/mL) 1 2 3 4 5 6 7
Mẫu trắng (ethanol khan) 0 50 100 150 200 250 250 250 200 150 100 50 0 0 250 250 250 250 250 250
Lắc đều và ủ 30 phút trong bóng tối ở điều kiện phòng.