2.6.1.1 Giới thiệu phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography) chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp phụ. Trong đó, pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một lớp chất hấp phụ trơ như: silica gel hoặc aluminium oxyde, chất hấp phụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm
17
plastic. Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy.
Pha tĩnh: một lớp mỏng, thường khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp phụ, thí dụ như silica gel, Al2O3,… được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm, hoặc tấm placstic. Chất hấp phụ dính trên tấm giá đỡ nhờ calcium sunfate khan, tinh bột hoặc một loại polymer hữu cơ. Với chất hấp phụ là silica gel hoặc Al2O3, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm hoặc không di chuyển. Silica gel là chất hấp phụ được sử dụng thông dụng nhất, silica gel có cấu trúc hóa học như sau:
Si O O O O Si O O O Si O O O H H H
Mẫu cần phân tích: mẫu chất cần phân tích thường là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1 μL dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2 – 5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình.
Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai hay nhiều dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ vào lực mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với mỗi vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. Chất cần phân tích sẽ được phân bố trên pha tĩnh, sau đó cho pha động di chuyển ngang qua. Tùy vào ái lực giữa chất phân tích với pha tĩnh và pha động mà các cấu tử trong hỗn hợp chất sẽ được tách ra và di chuyển đến các vị trí khác nhau trên bản mỏng.
18
Vị trí của mỗi cấu tử trên bản mỏng được tính bằng giá trị Rf.
R𝑓 =a b =
Khoảng cách dịch chuyển chất tan Khoảng cách dịch chuyển pha động
Sắc ký chưa triển khai Sắc ký triển khai hoàn tất Hình 2.5: Cách tính giá trị Rf
Các chất trên bản mỏng có thể có màu dễ quan sát, cũng có thể không có màu. Để biết chính xác vị trí của các chất đó trên bản mỏng ta có thể dùng các thuốc thử đặc trưng để phát hiện, gọi là quá trình hiện vết. Các thuốc thử này được phun xịt lên bản mỏng hoặc nhúng nhanh bản mỏng vào dung dịch thuốc thử.
Bảng 2.1: Một vài thuốc thử hiện hình sắc ký lớp mỏng
Thuốc thử Màu của vết Hợp chất
Hơi I2 Vàng hoặc nâu Hợp chất hữu cơ nói chung
H2SO4đđ Vàng đậm đến da cam Flavon, Flavonol H2SO4đđ Màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ Chalcon, Auron
H2SO4đđ Màu cam đến đỏ Flavonoid
FeCl3 Xanh lục đến xanh đen Sesquiterpen H2SO4đđ Màu đỏ sậm (λmax: 545nm)
Màu xanh dương đen (λmax: 595nm)
Triterpen
Có thể sử dụng phương pháp phát hiện bằng tia tử ngoại (UV) để hiện hình vết trên bản mỏng. Các nhà sản xuất có bán sẵn dụng cụ để khảo sát bản mỏng bằng tia UV:
19
Đèn chiếu tia UV 254 nm: Ánh sang này để nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia UV. Các hợp chất sẽ tạo thành vết có màu tối sẫm.
Đèn chiếu tia UV 366 nm: Ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp chất có phát huỳnh quang. Các vết của chất mẫu có màu sáng trên nền bảng mỏng sẫm màu.
Các chất khác nhau thường sẽ có giá trị Rf khác nhau trong cùng điều kiện thử. Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi xác định.
Dung môi giải ly: nên chọn loại dung môi rẻ tiền, vì phải cần một lượng lớn, có độ tinh khiết cao, tránh có các vết kim loại. Dung môi không được quá dễ bay hơi, thí dụ như diethyl ether, nhiệt độ sôi xấp xỉ 35ºC, gần bằng nhiệt độ của phòng thí nghiệm vào mùa nóng (miền nam Việt Nam).
Một mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cấu tử khác nhau. Khả năng tách riêng các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tỷ lệ phân phối của các hợp chất này giữa chất hấp thu và dung môi giải ly. Muốn thay đổi khả năng tách, người thay đổi thành phần các dung môi sử dụng để giải ly, thông thường ta sử dụng hệ hai dung môi.
Nên tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều hơn hai cấu tử, vì hỗn hợp phức tạp như thế dễ dàng dẫn đến việc thay đổi pha khi có sự thay đổi nhiệt độ. Sự lựa chọn dung môi để tách tốt các chất khác nhau tùy thuộc vào kinh nghiệm cá nhân, những hiểu biết về các đặc tính của chất cần phân tích sẽ giúp ích cho người nghiên cứu [24].
2.6.1.2 Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng a. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng một chiều
Dung môi chạy cùng một chiều từ đầu dưới bản mỏng lên đầu trên bản mỏng. Lưu ý các vết mẫu chấm trên bản mỏng không được ngập vào dung môi trong bình triển khai vì mẫu chất sẽ bị khuếch tán ngay lập tức ra dung môi làm cho các vết bị lem.
b. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hai chiều
Trong hợp chất phân tích có nhiều cấu tử nên kỹ thuật sắc ký một chiều không đủ độ tin cậy thì tiến hành thêm kỹ thuật sắc ký hai chiều để kết quả tách được rõ ràng hơn.
20
Dùng loại bản mỏng 20 × 20, chấm chất phân tích ở góc bản cho vào bình sắc ký chạy hệ dung môi I, quay góc 90o, cho vào bình sắc ký chạy hệ dung môi II [24].
c. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative Chromatography)
SKLM điều chế còn được gọi là kỹ thuật sắc ký chế hóa, thường dùng để tách các chất với lượng nhỏ và có Rf cách xa nhau.
Dùng kỹ thuật SKLM một chiều, bản mỏng có kích thước 20 x 20 cm, độ dày chất hấp phụ từ 0,5 – 1 mm.
Hỗn hợp cần tách được chấm lên bản mỏng thành một đường liên tục. Sau đó nhúng bản mỏng vào dung dịch triển khai thích hợp. Trường hợp Rf các chất trong hỗn hợp phân tích rất gần nhau có thể tiến hành làm lại nhiều lần, trước mỗi lần chạy lại phải sấy khô bản mỏng.
Phát hiện các vết tách bằng cách soi dưới đèn tử ngoại hoặc phun thuốc thử phát hiện ở một mép bản mỏng (thuốc thử không được phun hết lên bản mỏng vì sẽ phá vỡ cấu trúc của hợp chất để tạo phản ứng màu).
Đánh dấu vùng muốn tách mẫu, cạo riêng từng vùng.
Dùng dung môi thích hợp (có thể dùng dung môi triển khai) để lấy riêng mẫu chất ra khỏi chất hấp phụ, quá trình này gọi là phản hấp phụ [24].