2.3.1 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration)
Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chiết bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây.
Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài).
Dung môi sau khi được thu hồi, được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau [24].
2.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng (Liquid – liquid extraction)
Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.
Nguyên tắc: dung môi có tính phân cực khác nhau (yếu, trung bình, mạnh) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực tương ứng với nó. Đây là phương pháp dựa trên sự phân bố của chất tan vào hai pha và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau. Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng. Trong đó, cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào nước.
Việc chiết được thực hiện lần lượt bàng các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần. Với mỗi loại dung môi, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, đến khi chiết kiệt mới chuyển sang dung môi khác [24].
16
2.4 Phương pháp làm khô mẫu
Sấy khô bằng khí trơ trong máy cô quay chân không: khi cô quay chân không đến lúc mẫu đã khô hoàn toàn, cho một luồng khí trơ đi vào máy, đi nhè nhẹ từ đầu trên của máy cô quay (tại đầu trên của máy, chỗ đóng – mở áp suất để tạo chân không cho máy, có một ống để châm dung dịch vào bình cô quay mà không cần tắt ngưng máy, cho khí vào bằng ngõ này).
Sấy khô bằng bình hút ẩm: mẫu cần làm khô được đặt trong một becher, miệng của becher được đậy bằng một tờ giấy lọc, trên bề mặt tờ giấy lọc tạo một số lỗ nhỏ. Đặt becher vào bình hút ẩm, đậy nắp bình lại. Cho máy bơm hút hoạt động cho đến khi thấy mẫu chất khô thì ngừng máy.
2.5 Phương pháp kết tinh phân đoạn (Fraction recrystallization)
Trong một vài trường hợp đặc biệt, người ta có thể tách riêng một hợp chất ra khỏi hỗn hợp là nhờ vào độ tan khác nhau trong một dung môi nào đó, kỹ thuật này được gọi là kết tinh phân đoạn.
Thí dụ có một hỗn hợp gồm ba hợp chất A, B và C. Giả sử có thể tìm một dung môi hòa tan vô hạn B và C ở bất kì nhiệt độ nào và chỉ hòa tan A bình thường. Thực hành bằng cho hỗn hợp vào dung môi nóng, lọc nóng qua tờ giấy lọc. Để yên cho dung môi nguội từ từ, hợp chất A sẽ kết tinh lại thành chất rắn (dĩ nhiên là có kết tinh lẫn theo nó một ít B và C), trong khi đó lượng lớn B và C vẫn còn lại ở trong dung dịch. Lọc để lấy riêng tinh thể A. Thực hành việc kết tinh như thế thêm vài lần nữa bằng dung môi tinh khiết sẽ có tinh thể A tinh khiết.
Thực hiện như thế có nhược điểm là hao hụt sản phẩm chính, có thể khắc phục bằng cách nhập hai lần dung dịch nước cái của lần kết tinh một và hai, cô quay để thu hồi hợp chất và thực hiện kết tinh lại.
2.6 Phương pháp sắc ký
2.6.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
2.6.1.1 Giới thiệu phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography) chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp phụ. Trong đó, pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một lớp chất hấp phụ trơ như: silica gel hoặc aluminium oxyde, chất hấp phụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm
17
plastic. Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy.
Pha tĩnh: một lớp mỏng, thường khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp phụ, thí dụ như silica gel, Al2O3,… được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm, hoặc tấm placstic. Chất hấp phụ dính trên tấm giá đỡ nhờ calcium sunfate khan, tinh bột hoặc một loại polymer hữu cơ. Với chất hấp phụ là silica gel hoặc Al2O3, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm hoặc không di chuyển. Silica gel là chất hấp phụ được sử dụng thông dụng nhất, silica gel có cấu trúc hóa học như sau:
Si O O O O Si O O O Si O O O H H H
Mẫu cần phân tích: mẫu chất cần phân tích thường là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1 μL dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2 – 5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình.
Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai hay nhiều dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ vào lực mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với mỗi vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. Chất cần phân tích sẽ được phân bố trên pha tĩnh, sau đó cho pha động di chuyển ngang qua. Tùy vào ái lực giữa chất phân tích với pha tĩnh và pha động mà các cấu tử trong hỗn hợp chất sẽ được tách ra và di chuyển đến các vị trí khác nhau trên bản mỏng.
18
Vị trí của mỗi cấu tử trên bản mỏng được tính bằng giá trị Rf.
R𝑓 =a b =
Khoảng cách dịch chuyển chất tan Khoảng cách dịch chuyển pha động
Sắc ký chưa triển khai Sắc ký triển khai hoàn tất Hình 2.5: Cách tính giá trị Rf
Các chất trên bản mỏng có thể có màu dễ quan sát, cũng có thể không có màu. Để biết chính xác vị trí của các chất đó trên bản mỏng ta có thể dùng các thuốc thử đặc trưng để phát hiện, gọi là quá trình hiện vết. Các thuốc thử này được phun xịt lên bản mỏng hoặc nhúng nhanh bản mỏng vào dung dịch thuốc thử.
Bảng 2.1: Một vài thuốc thử hiện hình sắc ký lớp mỏng
Thuốc thử Màu của vết Hợp chất
Hơi I2 Vàng hoặc nâu Hợp chất hữu cơ nói chung
H2SO4đđ Vàng đậm đến da cam Flavon, Flavonol H2SO4đđ Màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ Chalcon, Auron
H2SO4đđ Màu cam đến đỏ Flavonoid
FeCl3 Xanh lục đến xanh đen Sesquiterpen H2SO4đđ Màu đỏ sậm (λmax: 545nm)
Màu xanh dương đen (λmax: 595nm)
Triterpen
Có thể sử dụng phương pháp phát hiện bằng tia tử ngoại (UV) để hiện hình vết trên bản mỏng. Các nhà sản xuất có bán sẵn dụng cụ để khảo sát bản mỏng bằng tia UV:
19
Đèn chiếu tia UV 254 nm: Ánh sang này để nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia UV. Các hợp chất sẽ tạo thành vết có màu tối sẫm.
Đèn chiếu tia UV 366 nm: Ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp chất có phát huỳnh quang. Các vết của chất mẫu có màu sáng trên nền bảng mỏng sẫm màu.
Các chất khác nhau thường sẽ có giá trị Rf khác nhau trong cùng điều kiện thử. Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi xác định.
Dung môi giải ly: nên chọn loại dung môi rẻ tiền, vì phải cần một lượng lớn, có độ tinh khiết cao, tránh có các vết kim loại. Dung môi không được quá dễ bay hơi, thí dụ như diethyl ether, nhiệt độ sôi xấp xỉ 35ºC, gần bằng nhiệt độ của phòng thí nghiệm vào mùa nóng (miền nam Việt Nam).
Một mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cấu tử khác nhau. Khả năng tách riêng các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tỷ lệ phân phối của các hợp chất này giữa chất hấp thu và dung môi giải ly. Muốn thay đổi khả năng tách, người thay đổi thành phần các dung môi sử dụng để giải ly, thông thường ta sử dụng hệ hai dung môi.
Nên tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều hơn hai cấu tử, vì hỗn hợp phức tạp như thế dễ dàng dẫn đến việc thay đổi pha khi có sự thay đổi nhiệt độ. Sự lựa chọn dung môi để tách tốt các chất khác nhau tùy thuộc vào kinh nghiệm cá nhân, những hiểu biết về các đặc tính của chất cần phân tích sẽ giúp ích cho người nghiên cứu [24].
2.6.1.2 Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng a. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng một chiều
Dung môi chạy cùng một chiều từ đầu dưới bản mỏng lên đầu trên bản mỏng. Lưu ý các vết mẫu chấm trên bản mỏng không được ngập vào dung môi trong bình triển khai vì mẫu chất sẽ bị khuếch tán ngay lập tức ra dung môi làm cho các vết bị lem.
b. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hai chiều
Trong hợp chất phân tích có nhiều cấu tử nên kỹ thuật sắc ký một chiều không đủ độ tin cậy thì tiến hành thêm kỹ thuật sắc ký hai chiều để kết quả tách được rõ ràng hơn.
20
Dùng loại bản mỏng 20 × 20, chấm chất phân tích ở góc bản cho vào bình sắc ký chạy hệ dung môi I, quay góc 90o, cho vào bình sắc ký chạy hệ dung môi II [24].
c. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative Chromatography)
SKLM điều chế còn được gọi là kỹ thuật sắc ký chế hóa, thường dùng để tách các chất với lượng nhỏ và có Rf cách xa nhau.
Dùng kỹ thuật SKLM một chiều, bản mỏng có kích thước 20 x 20 cm, độ dày chất hấp phụ từ 0,5 – 1 mm.
Hỗn hợp cần tách được chấm lên bản mỏng thành một đường liên tục. Sau đó nhúng bản mỏng vào dung dịch triển khai thích hợp. Trường hợp Rf các chất trong hỗn hợp phân tích rất gần nhau có thể tiến hành làm lại nhiều lần, trước mỗi lần chạy lại phải sấy khô bản mỏng.
Phát hiện các vết tách bằng cách soi dưới đèn tử ngoại hoặc phun thuốc thử phát hiện ở một mép bản mỏng (thuốc thử không được phun hết lên bản mỏng vì sẽ phá vỡ cấu trúc của hợp chất để tạo phản ứng màu).
Đánh dấu vùng muốn tách mẫu, cạo riêng từng vùng.
Dùng dung môi thích hợp (có thể dùng dung môi triển khai) để lấy riêng mẫu chất ra khỏi chất hấp phụ, quá trình này gọi là phản hấp phụ [24].
2.6.2 Phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột hấp phụ được tiến hành trên một cột thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột là pha động chảy qua chất hấp phụ.
Đây là một trong những kỹ thuật nhằm phân đoạn cao thô ban đầu ra thành các phân đoạn cao nhỏ hơn, có độ phân cực khác nhau, hoặc cô lập ra hợp chất tinh khiết từ một phân đoạn cao nhỏ [24].
2.6.2.1 Chuẩn bị cột
Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn trong cột phải phân tán đồng đều ở mỗi điểm trong cột thành một khối đồng nhất.
Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch).
21
2.6.2.2 Cho chất hấp phụ vào cột
Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay đổi thông thường từ 1/20, 1/30, 1/50, 1/100,…
Tỷ lệ =Trọng lượng chất phân tích
Trọng lượng chất hấp phụ Có hai cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô.
Nhồi cột ướt: dùng cho các chất hấp phụ có khả năng trương phình như silica gel, sephadex,…
Nhồi cột khô: dùng cho các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như Al2O3, CaCO3,…
2.6.2.3 Đưa chất phân tích vào cột
Yêu cầu việc đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán chất thử thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều phương pháp đưa chất phân tích vào cột như:
Cho thẳng dung dịch thử lên cột: hòa tan chất phân tích vào một lượng vừa đủ dung môi (càng ít càng tốt).
Trộn chất thử với một lượng chất hấp phụ: trộn dung dịch chất phân tích với một lượng nhỏ chất hấp phụ cho thật đều, sấy khô rồi cho vào cột bằng cách rải thành một lớp đều đặn trên mặt cột.
Trong hai phương pháp trên, phương pháp cho thẳng dung dịch vào cột là gọn và nhanh hơn cả, nhưng phải đảm bảo các yêu cầu kỹ thuật sau:
Chất thử hòa tan hoàn toàn.
Dung dịch chất thử phải nạp vào cột đều.
Khi toàn bộ chất thử ngấm hết vào cột, mới cho tiếp dung môi mới.
2.6.2.4 Giải ly cột
Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà người ta có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc bằng áp suất nén:
- Giải ly cột bằng áp suất thường: có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ có kích thước hạt lớn.
- Giải ly cột bằng áp suất nén: người ta thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen hoặc không khí) vào đầu cột.
22
Ở sắc ký cột cổ điển, dung môi rửa cột được dùng với độ phân cực tăng dần. Dung môi phải tinh khiết, vì những tạp chất lẫn vào dung môi thường làm thay đổi độ phân cực của dung môi đó, vì thế người ta thường chưng cất dung môi trước khi sử dụng.
Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển từ từ bằng cách pha tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần. Nếu tăng tính phân cực nhanh và đột ngột có thể làm gãy cột.
Trên thực tế nhiều khi dùng những dung môi thông thường không tách được nên người ta thường dùng hỗn hợp nhiều dung môi.
2.6.2.5 Theo dõi quá trình giải ly cột
Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được theo dõi bằng mắt thường. Tuy nhiên, đa số hợp chất hữu cơ tự nhiên đều không có màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột thường bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Thường trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo để chọn chất hấp phụ và dung môi. Tiến hành thăm dò bằng sắc ký lớp mỏng để tìm ra hệ dung môi tách tốt nhất.
2.7 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH acetate bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH
2.7.1 Nguyên tắc
DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517 nm. Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hoà gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại, màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.
2.7.2 Cơ chế N N N NO2 O2N NO2 RH N NH NO2 O2N NO2 R
1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (free radical) 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazine(nonradical)
23
Khả năng ức chế gốc tự do DPPH được xác định thông qua phần trăm ức chế I (%) được tính theo công thức sau:
I(%) = Ac−As
Ac × 100