3.1.1. Nuôi cấy chủng E. coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men 5 lít
Dựa trên kết quả nghiên cứu của Lê Thị Lan Anh và các cộng sự năm 2013 về nghiên cứu tối ưu biểu hiện Interleukin-2 dạng cải biến trong E. coli [1], chủng
E. coli mang gene mã hóa IL-2 được tiến hành lên men thử nghiệm lần đầu trong
nồi lên men quy mô 5 lít với các thông số sau: cảm ứng ở nhiệt độ 47ºC ở thời điểm giá trị OD600 đạt khoảng 0,5 với nồng độ chất cảm ứng là 1 mM IPTG, thu mẫu sau khi cảm ứng 5 giờ. Kết quả điện di mẫu protein tổng số sau khi lên men được thể hiện ở Hình 8.
43
A B
Hình 8. Điện di protein tái tổ hợp IL-2 sau khi lên men bằng hệ thống lên men 5 lít
A : Kết quả điện di SDS-PAGE. B : Kết quả Western blot
Đường chạy M: Thang protein chuẩn (Hình A Fermentas#SM0431 ; Hình B Fermentas#SM0671)
Đường chạy 1 : Mẫu đối chứng dương IL-2 chuẩn (Trung Quốc) Đường chạy 2 : Mẫu protein tổng số
Sau khi kết thúc quá trình lên men tổng hợp protein tái tổ hợp IL-2, dịch protein tổng số được đưa về cùng giá trị số lượng tế bào (OD600=10) sau đó đem biến tính và tiến hành điện di SDS-PAGE, rồi nhuộm coomassie và tiến hành phương pháp xác định IL-2 đặc hiệu nhờ phản ứng lai miễn dịch Western blot.
Kết quả điện di SDS-PAGE mẫu protein tổng số sau khi lên men chủng E. coli BL21 IL-2 thể hiện trên Hình 8A cho thấy chủng tái tổ hợp E. coli BL21 IL-2 đã bước đầu biểu hiện thành công protein IL-2, trên đường chạy có băng protein kích thước khoảng 15 kDa (kích thước lý thuyết dạng đơn của IL-2) rõ nét và đậm hơn so với các băng còn lại. Kết quả lai miễn dịch Western blot trên Hình 8B cho thấy IL-2 tái tổ hợp có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể đơn dòng kháng IL- 2 nhờ phản ứng kháng nguyên – kháng thể, trên đường chạy mẫu chỉ xuất hiện một
44
băng duy nhất cùng vị trí với băng đậm ở kết quả điện di. Điều này khẳng định rằng protein IL-2 đã được tổng hợp thành công trong chủng tái tổ hợp E. coli BL21 IL-2.
Quá trình sinh trưởng của vi khuẩn nói chung và chủng E. coli nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ, nồng độ và thành phần chất dinh dưỡng bổ sung, nồng độ oxy hòa tan, độ pH của môi trường [15]. Đối với chủng vi khuẩn sản xuất protein tái tổ hợp, nồng độ chất cảm ứng và thời điểm bổ sung chất cảm ứng để biểu hiện protein cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của chủng. Trong những nghiên cứu trước đây của phòng Kỹ thuật di truyền, chúng tôi đã tối ưu được điều kiện biểu hiện của chủng E. coli BL21 IL-2 ở quy mô phòng thí nghiệm [1], tuy nhiên quá trình biểu hiện protein ở hệ thống lên men có những điều kiện khác với quy mô này. Vì vậy, để tối ưu quá trình sinh tổng hợp IL-2 ở hệ thống lên men, chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men như nhiệt độ, thành phần và nồng độ chất dinh dưỡng bổ sung, nồng độ chất cảm ứng.
3.1.2. Khảo sát thành phần dinh dưỡng
Thành phần chất dinh dưỡng bổ sung vào môi trường nuôi cấy có vai trò quan trọng trong quá trình tăng sinh khối của tế bào. Một số thành phần dinh dưỡng như glucose, glycerol, cao nấm men hoặc chất cảm ứng IPTG có thể làm thay đổi sự tổng hợp của protein tái tổ hợp khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Cao nấm men là nội bào của tế bào nấm men, bao gồm tế bào chất, nhân tế bào và các cơ quan tế bào và thường rất giàu amino acid, vitamin (vitamin B, Glutathione), cacbon hydrat và muối. Cao nấm men được sử dụng rất phổ biến như một nguồn nitrogene phong phú, glucose và glycerol cũng được sử dụng như những nguồn carbon và nguồn năng lượng thiết yếu bổ sung trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn nói chung và E. coli nói riêng, đặc biệt là glucose, thành phần quan trọng trong con đường chuyển hóa cơ bản của tế bào [8].
Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành bổ sung glucose và glycerol đến nồng độ cuối cùng là 1% kết hợp cao nấm men nồng độ cuối cùng 0,5% và thay đổi
45
nồng độ IPTG với các lần cảm ứng khác nhau để tìm ra điều kiện tối ưu làm tăng sự tổng hợp IL-2. Kết quả khảo sát được thể hiện trên Hình 9.
Hình 9. Điện di sản phẩm protein tổng số trong điều kiện thay đổi thành phần chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy
Đường chạy M: Thang protein chuẩn (Fermentas #SM0431)
Đường chạy 1, 3, 5: Bổ sung glucose và cao nấm men đến nồng độ cuối cùng lần lượt là 1% và 0,5%
Đường chạy 2, 4, 6: Bổ sung glycerol và cao nấm men đến nồng độ cuối cùng lần lượt là 1% và 0,5%
Đường chạy 1,2: Cảm ứng 1 lần, nồng độ cuối cùng 1 mM IPTG Đường chạy 3,4: Cảm ứng 1 lần, nồng độ cuối cùng 0,5 mM IPTG
Đường chạy 5,6: Cảm ứng 2 lần cách nhau 1 giờ đồng hồ, mỗi lần bổ sung đến nồng độ cuối cùng 0,5 mM IPTG
Đường chạy (+) (-): Đối chứng dương (IL-2 chuẩn), đối chứng âm (chủng không mang gene il-2)
Kết quả sau khi dừng quá trình lên men cho thấy, tất cả các mẫu lên men được bổ sung chất dinh dưỡng đều có giá trị OD600 khi thu mẫu cao hơn từ 8-10 lần so với mẫu đối chứng không được bổ sung chất dinh dưỡng. Tuy nhiên, kết quả điện di trên Hình 9 cho thấy, băng protein IL-2 được biểu hiện đậm nhất ở đường chạy số 1 và số 3, đây là các mẫu lên men bổ sung chất dinh dưỡng là glucose và
46
cao nấm men, trong đó mẫu số 1 được cảm ứng bằng IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1 mM so với mẫu số 3 là 0,5 mM. Từ kết quả này chúng tôi chọn áp dụng bổ sung chất dinh dưỡng là glucose đến nồng độ cuối cùng là 1% và cao nấm men là 0,5% ở các lần lên men tiếp theo, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM.
3.1.3. Khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng E. coli BL21 IL-2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi chọn được điều kiện bổ sung dinh dưỡng trong quá trình lên men, chúng tôi khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng tái tổ hợp E. coli BL21 IL-2 so với chủng đối chứng E. coli BL21 không mang gene mã hóa IL-2 để tìm thời điểm thích hợp nhất cho quá trình cảm ứng và quá trình bổ sung chất dinh dưỡng. Kết quả được thể hiện trên hình sau.
Hình 10. Khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng tái tổ hợp so với chủng đối chứng (E. coli BL21 không mang gene mã hóa IL-2)
Dựa trên kết quả Hình 10 ta thấy, chủng tái tổ hợp có thể đạt giá trị OD600 cao nhất là khoảng 18-20 sau khoảng 12 giờ nuôi cấy, trong khi chủng đối chứng không mang gene thì giá trị này chỉ đạt khoảng 10-12. Dạng đường cong sinh trưởng của hai chủng là tương tự nhau. Khi khảo sát chúng tôi bổ sung chất dinh dưỡng vào các thời điểm 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, kết quả cho thấy cả hai chủng đều sinh trưởng nhanh vào khoảng thời gian 1 giờ sau khi bổ sung chất dinh dưỡng hai lần
47
đầu tiên, và gần như không tăng sinh sau 9 giờ dù có được bổ sung chất dinh dưỡng; vì vậy, chúng tôi chọn bổ sung chất dinh dưỡng hai lần sau khi bắt đầu lên men, mỗi lần cách nhau khoảng 3 giờ đồng hồ để thúc đẩy sự sinh trưởng của chủng tái tổ hợp. Ngoài ra, chủng tái tổ hợp có thể đạt đến giá trị OD khá cao (khoảng 20) nên sẽ được cảm ứng ở giá trị OD600 khoảng 15-16.
3.1.4. Lên men chủng E. coli BL21 IL-2 đợt 2
Quá trình lên men đợt 2 có bổ sung dinh dưỡng 2 lần vào các thời điểm lên men 3 giờ và 5,5 giờ, cảm ứng IPTG nồng độ cuối cùng 0,1 mM khi OD600 đạt 16,3 vào thời điểm lên men 5,5 giờ, dừng lên men sau 6 giờ cảm ứng OD600 đạt 17,4 (Hình 11).
A B
Hình 11. Lên men chủng tái tổ hợp E. coli BL21 IL-2 đợt 2
A: Đường cong sinh trưởng. B: Điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 12,6%.
Đường chạy M: Thang protein chuẩn (Fermentas #SM0431);
Đường chạy 1-6: Dịch protein tổng số ở các thời điểm 1-6 giờ sau khi cảm ứng;
48
Kết quả trên Hình 11 cho thấy sự thay đổi quy trình biểu hiện IL-2 so với đợt 1 với việc chỉ bổ sung 2 lần glucose 1% và cao nấm men 0,5% và giảm nồng độ cảm ứng IPTG xuống 0,1 mM thì chủng E. coli BL21-IL2 vẫn phát triển tốt và đạt OD600 là 20 sau 10 giờ lên men. Theo quy trình này thời gian thu mẫu tăng lên từ 3 giờ lên 6 giờ và giá trị OD600 thu mẫu đạt khoảng OD600 là 18. Như vậy quy trình này sẽ tiết kiệm được chi phí lên men do giảm thành phần bổ sung dinh dưỡng; giảm nồng độ IPTG mà kết quả thu được là sự sinh trưởng của chủng E. coli BL21- IL2 tốt hơn so với đợt lên men ban đầu. Để kiểm tra khả năng biểu hiện của chủng này chúng tôi đã điện di kiểm tra sản phẩm lên men trên SDS-PAGE với các mẫu lên men thu được ở các giờ khác nhau. Kết quả trên Hình 11B cho thấy lượng protein được tổng hợp tăng dần sau khi cảm ứng IPTG (từ 1 đến 6 giờ). Kết quả lên men này là cơ sở để thực hiện các bước tinh chế protein IL-2 sau này.
3.2. Siêu âm phá tế bào và xử lý tiền tinh chế mẫu protein Interleukin-2 tái tổ hợp hợp
E. coli là một hệ vật chủ biểu hiện protein tái tổ hợp ngoại lai rất hiệu quả
với nhiều ưu điểm và thường được sử dụng để biểu hiện các protein mà không cần có quá trình cải biến sau dịch mã [52]. Tuy nhiên do mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp cao nên các protein tái tổ hợp thường tồn tại ở dạng không tan trong thể vùi phía trong nội bào, ngoại trừ một số protein được thiết kế đặc biệt để tiết ra ngoài khoang gian bào. Điều này giúp cho quá trình tinh chế protein tái tổ hợp khá đơn giản, chỉ bằng phương pháp phân tách dựa theo khối lượng, tuy nhiên cần phải có phương pháp xử lý phá tế bào, giải phóng protein nội bào một cách triệt để. Có nhiều phương pháp để phá tế bào nhưng phương pháp dùng sóng siêu âm cường độ cao được sử dụng khá phổ biến, ngoài ra còn một số phương pháp khác như sốc nhiệt, dùng hóa chất – enzyme, nghiền đồng thể, … Kết quả siêu âm phá tế bào thu protein tổng số của mẫu lên men chủng E. coli BL21 IL-2 được thể hiện trên hình ảnh sau.
49
Hình 12. Điện di mẫu siêu âm phá tế bào theo thời gian Đường chạy M: Thang protein chuẩn (Fermentas #SM0431).
Mẫu 1-7: Thời gian siêu âm lần lượt là 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 phút. Mấu S: Dịch nổi sau khi ly tâm của mẫu protein tổng số sau siêu âm. Mẫu P: Tủa không tan sau khi ly tâm của mẫu protein tổng số sau siêu âm.
Sinh khối tế bào sau khi lên men được ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút để thu tủa tế bào, loại bỏ dịch môi trường, quá trình này nhằm lược bỏ bớt các tạp chất trong môi trường lên men, từ đó tạo điều kiện cho quá trình tinh chế sau này. Sau đó tủa tế bào được hòa lại trong dung dịch đệm Tris-HCl trước khi tiến hành siêu âm để phá tế bào. Kết quả trên Hình 12 cho thấy, mẫu sau khi siêu âm phá tế bào 9 phút đã được phá vỡ khá hoàn toàn, thể hiện ở việc so với các mẫu 3 phút và 6 phút, dịch nổi sau khi siêu âm có các băng đậm hơn hẳn cũng như tủa sau khi ly tâm có các băng tạp nhạt hơn rõ rệt. Từ các mẫu siêu âm 12 phút trở đi, không có sự khác biệt đáng kể về lượng protein trong các đường chạy so với mẫu siêu âm 9 phút, điều này chứng tỏ tế bào đã được phá vỡ khá tốt. Chúng tôi chọn thời gian siêu âm sau này là 10 phút để tiết kiệm chi phí và thời gian mà vẫn đảm bảo hiệu quả.
50
Việc biến tính và hòa tan các protein không tan trong thể vùi là một bước vô cùng quan trọng trong quá trình tinh chế. Để làm biến tính protein, phương pháp phổ biến là sử dụng các chất có hoạt tính mạnh trong việc phá vỡ mạng lưới liên kết hydro trong dung dịch như urea, guanidine hydrochloride (GuHCl) [51]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn sử dụng GuHCl. Guanidine hydrochloride là một chất rất hiệu quả trong việc phá vỡ cấu trúc bậc cao và các liên kết không đặc hiệu của phân tử, giúp chuyển từ dạng không tan thành dạng tan. Nồng độ GuHCl thích hợp để biến tính protein được khảo sát trong thí nghiệm sau.
Hình 13. Điện di SDS-PAGE mẫu protein sau khi biến tính bằng GuHCl, xử lý ly tâm thu tủa không tan.
Đường chạy M: Thang protein chuẩn (Fermentas #SM0431).
Đường chạy 1 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M, 7 M: tủa protein sau khi ly tâm từ dịch đã được xử lý bằng GuHCl với nồng độ tương ứng.
Từ kết quả trên Hình 13 ta thấy, với nồng độ GuHCl 1 M, 2 M, lượng protein IL-2 được hòa tan còn khá thấp, băng protein trên bản điện di vẫn rất đậm và rõ nét. Từ nồng độ GuHCl 3 M trở đi, đã bắt đầu có sự hòa tan tủa protein trong thể vùi, bao gồm cả IL-2. Ở nồng độ GuHCl 6 M, protein gần như đã được hòa tan hoàn toàn, chỉ còn lại một băng rất mờ và ở nồng độ GuHCl 7 M, hoàn toàn không còn dấu hiệu của protein trong tủa sau khi ly tâm. Nói cách khác, thể vùi chứa IL-2 cuộn gập không đúng cấu trúc dẫn đến sự kết tủa của protein tái tổ hợp đã được chuyển
51
thành dạng hòa tan bằng GuHCl ở nồng độ cao. Để đảm bảo cho sự thu hồi tối đa lượng IL-2 trong quá trình tiền xử lý, chúng tôi chọn nồng độ GuHCl 7 M cho các bước hòa tan và biến tính protein thể vùi chứa IL-2 sau này.
Dung dịch GuHCl nồng độ cao như đã nghiên cứu ở trên có khả năng hòa tan protein tái tổ hợp IL-2 từ dạng kết tụ trong thể vùi; tuy nhiên, bên cạnh IL-2 còn có nhiều loại protein tạp khác cũng được hòa tan trong dung dịch này vì một số loại protein nội bào của E. coli cũng bị đồng kết tủa với IL-2 trong thể vùi. Sự pha loãng dung dịch này dẫn đến sự giảm nồng độ của GuHCl và chuyển protein IL-2 tái tổ hợp từ dạng tan trở lại dạng không tan, ly tâm dung dịch trên ở tốc độ cao sẽ thu được IL-2 ở trong tủa. Tuy nhiên, trong quá trình này, một số loại protein tạp không bị tái kết tủa ở nồng độ GuHCl thấp nhất định mà vẫn tồn tại ở dạng tan, vì vậy có thể tách những protein tạp này ra khỏi IL-2 bằng phương pháp đơn giản là ly tâm. Công đoạn hạ nồng độ chất biến tính GuHCl là một bước quan trọng để loại bỏ tối đa các tạp chất trong quá trình tinh sạch IL-2. Phương pháp điện di SDS-PAGE mẫu tủa protein sau khi pha loãng dịch GuHCl và ly tâm cho phép đánh giá được nồng độ pha loãng GuHCl phù hợp nhất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 14. Điện di SDS-PAGE mẫu protein sau khi biến tính bằng GuHCl, giảm nồng độ GuHCl để thu hồi protein ở dạng tủa
52
Đường chạy 1 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M: Mẫu protein trong tủa sau khi ly tâm dịch GuHCl nồng độ cao đã pha loãng về các nồng độ tương ứng
Kết quả trên Hình 14 cho thấy không có dấu hiệu của sự tái kết tủa protein ở