* Cơ sở lý thuyết
Điện di là quá trình dịch chuyển của phân tử dưới tác dụng của điện trường qua các mạng lưới. Các phân tử có tốc độ di chuyển tùy thuộc vào điện tích, kích thước khối lượng, hình dạng phân tử. Khi protein được xử lý với SDS là chất mang điện âm có khả năng bám vào protein làm protein tích điện tích âm đồng thời biến tính protein, phá vỡ cấu trúc bậc tạo tạo thành cấu trúc bậc I (dạng thẳng). Do cùng có điện tích và là dạng thẳng nên protein có tốc độ di chuyển tỉ lệ nghịch với kích thước, khối lượng phân tử.
* Chuẩn bị điện di:
Lắp bản gel vào bộ điện di, kiểm tra đảm bảo đệm đổ vào trong không bị thất thoát ra ngoài. Tra mẫu điện di vào các giếng theo thứ tự biết trước bằng pipet với lượng từ 5-10 μl, riêng marker 3 μl. Sau khi tra xong lắp điện cực (chú ý đúng điện cực tương ứng) và bắt đầu chạy điện di.
* Chương trình điện di:
+ Đối với 1 bản gel: cường độ dòng điện giữ không đổi là 10 mA trong 15 phút sau đó tăng cường độ dòng điện lên 20 mA trong khoảng 50-70 phút đến khi vạch màu chỉ thị chạy gần hết bản gel.
+ Đối với 2 bản gel: cường độ dòng điện giữ không đổi là 20 mA trong 15 phút sau đó tăng cường độ dòng điện lên 40 mA trong khoảng 50-70 phút đến khi vạch màu chỉ thị chạy gần hết bản gel.
36
* Hiện kết quả chạy điện di bằng phương pháp nhuộm coomassie
Bàn gel sau khi chạy điện di xong được gỡ ra đĩa petri và xử lý với các dung dịch dành cho phương pháp nhuộm coomassie theo trình tự sau: dung dịch nhuộm màu tối thiểu 1 giờ (bước này có thể tiến hành qua đêm), dung dịch rửa trong 30 phút 1 lần cho đến khi bản gel hiện rõ các băng và nền bản gel không còn màu của thuốc nhuộm.
* Hiện kết quả chạy điện di bằng phương pháp nhuộm bạc
Bàn gel sau khi chạy điện di xong được gỡ ra và xử lý với các dung dịch dành cho phương pháp nhuộm bạc theo trình tự sau: dung dịch cố định (Fixing solution) tối thiểu 1 giờ, dung dịch rửa (Washing solution) trong 20 phút (tiến hành 2 lần liên tiếp), dung dịch nhạy hóa (Sensitising solution) trong 1 phút, nước loại ion trong 20 giây (thực hiện 3 lần liên tiếp), dung dịch nhuộm bạc (Silver staining solution) trong 20-30 phút, nước loại ion trong 20 giây (tiến hành 2 lần liên tiếp), dung dịch hiện màu (Developing solution) trong 1-3 phút, dung dịch ngừng phản ứng (Stopping solution) trong khoảng 10-30 giây.
Lưu ý trong bước xử lý bằng dung dịch hiện màu, dùng tay lắc nhẹ đĩa đựng bản gel để ngấm đều dung dịch và quan sát đến khi các băng điện di hiện rõ thì chuyển ngay sang bước tiếp theo, tránh bàn gel điện di bị ngâm quá lâu trong dung dịch hiện màu sẽ làm đen toàn bộ bản gel.
2.2.5. Phương pháp kiểm tra protein bằng phản ứng đặc hiệu miễn dịch Western Blot
Western blotting là phương pháp được sử dụng để nhận diện một kháng nguyên đặc hiệu nhờ các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng tương ứng.
* Nguyên lý:
Một protein kháng nguyên bất kỳ (antigen) khi đưa vào cơ thể động vật (người, thỏ, chuột), cơ thể nhận sẽ nhận biết kháng nguyên rồi tổng hợp ra một kháng thể (antibody) tương ứng với kháng nguyên. Kháng thể này mang tính đặc hiệu với kháng nguyên đưa vào. Khi kháng thể gặp kháng nguyên chúng sẽ bắt cặp
37
đặc hiệu với nhau. Trong phép lai Western blotting này, các mẫu dò dùng để lai là thể protein kháng thể tương ứng với protein cần phát hiện cũng được đánh dấu bằng chất gây phản ứng màu.
* Quy trình:
Mẫu protein được chạy điện di biến tính bằng SDS-PAGE với các vị trí tương ứng, khi gỡ gel điện di thì đặt vào trong dung dịch blotting 1x để lạnh, tránh gel bị khô.
Màng PVDF được ngâm trong methanol 100% trong 5 phút trước khi chuyển sang dung dịch blotting. Hộp chuyển màng, xốp, giấy thấm và màng PVDF được đặt vào khay đựng blotting 1x lạnh. Màng và gel được đặt vào hộp chuyển theo thứ tự mặt đen của hộp chuyển (cực âm), xốp, giấy thấm, gel, màng PVDF, giấy thấm, xốp, mặt trắng của hộp chuyển (cực dương). Lắp hộp vào bộ chuyển màng, đổ dung dịch blotting 1x vào ngập bộ chuyển màng, thêm đá vụn vào bộ chuyển màng cho nhiệt độ không lên quá cao. Sau đó chạy với hiệu điện thế 100V trong 2 giờ ở 4ºC, khuấy từ nhẹ.
Màng PVDF sau khi thực hiện quá trình chuyển màng được phủ bằng dung dịch sữa skim milk 5% trong dung dịch TBS, ở 4ºC qua đêm. Rửa màng bằng dung dịch TTBS, 3 lần mỗi lần 10 phút rồi rửa tiếp bằng dung dịch TBS, 3 lần mỗi lần 5 phút. Phủ kháng thể 1 (kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu IL-2) pha loãng về nồng độ cuối cùng khoảng 0,2-0,4 μg/ml trong sữa skim milk 5% (pha trong TBS), lắc ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
Màng PVDF được rửa bằng dung dịch TTBS và TBS lặp lại như trên trước khi phủ kháng thể 2 (cộng gộp kháng thể Ig G- kháng thể chuột gắn peroxidase ) pha loãng về nồng độ cuối cùng khoảng 0,2-0,4 μg/ml trong dung dịch sữa skim milk 5% pha trong TBS, lắc ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Sau khi phủ kháng thể 2, màng PVDF được rửa bằng TTBS và TBS như trên trước khi hiện mẫu trong dung dịch hiện màu của BioRad. Màng được lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và quan sát.
38