Chuẩn bị dung dịch gốc tá chất gồm có: 1% cyclodextrin (trọng lượng/thể tích) (Sigma), 10% PEG-400 (thể tích/thể tích), 10% tween-20 (thể tích/thể tích) (Sigma), 40% sucrose (trọng lượng/thể tích) (Sigma), 20% manitol (trọng lượng/thể tích) (Merck), 5% SDS (trọng lượng/thể tích) (Merck), 300 mM glycine (Sigma).
Các dung dịch này được lọc khuẩn bằng màng lọc 0,22 µm (Millipore) trước khi tiến hành pha chế theo hỗn hợp.
Dịch IL-2 sau tinh chế được pha loãng về nồng độ 0,5 mg/ml.
Các thành phần tá dược được chuẩn bị và trộn đều theo thứ tự như trong bảng trước khi tiến hành bổ sung dịch IL-2 tinh chế để đảm bảo không xảy ra sự kết tủa hay phản ứng giữa các thành phần. IL-2 tinh chế được bổ sung một cách từ từ vào trong hỗn hợp tá chất. Chú ý lắc nhẹ nhàng để tránh tạo bọt khí trong qúa trình trộn hai dung dịch.
Bảng 4. Bảng công thức pha chế bán thành phẩm
Thành phần 10 ml hỗn hợp pha chế IL-2 tái tổ hợp bán thành phẩm
A B C D E F (-) Cyclodextrin (ml) 1 1 - - - - - Glycine (ml) 0,5 1 1 1 1 - - PEG-400 (µl) 50 - - - 10 - - Tween-20 (µl) 50 - - - 10 - - Sucrose (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - - SDS (µl) 20 - - 20 - - - Manitol (ml) 1 0,5 0,5 0,5 0,5 - - IL-2 (ml) 7 7 7 7 7 7 - H2O (ml) 0 - 1 1 1 3 10
39 * Chu trình làm đông và rã đông:
Dịch IL-2 bán thành phẩm chuẩn bị ở trên được chia đều vào các ống với thể tích 1,1 ml mỗi ống. Các ống được đặt trong hộp ở nhiệt độ âm sâu (-80oC) trong 10 đến 12 giờ (hoặc qua đêm), sau đó đem đông khô. Mẫu sau khi đông khô được đem hoàn nguyên về đúng thể tích ban đầu và kiểm tra độ đục.
* Quá trình đông khô và hoàn nguyên:
10 ml dung dịch IL-2 bán thành phẩm được tiến hành đóng lọ trong điều kiện đảm bảo vô trùng và được đánh tên theo thứ thự A, B, C,… tương ứng với các hỗn hợp nêu trên. Các mẫu IL-2 bán thành phẩm sau đó được tiến hành đông khô trong khoảng thời gian 30 giờ. Các ống IL-2 thành phẩm sau đó được sử dụng cho quá trình kiểm tra độ đục và hoạt tính sinh học ở các bước tiếp theo.
Hoàn nguyên 1,1 ml nước cất pha tiêm vào mỗi ống IL-2 thành phẩm bao gồm 06 ống tương ứng với các hỗn hợp từ A đến F. 01 ống IL-2 Trung Quốc được sử dụng làm ống đối chứng dương (mỗi ml IL-2 Trung Quốc chứa 1,1 mg IL-2; 50 mg manitol; 0,18 mg SDS; 0,17 mg NaH2PO4; 0,89 mg Na2HPO4; pH 7,5). 01 đối chứng âm với các thành phần được mô tả ở bảng 4 (mẫu (-)).
Để đánh giá độ đục của các mẫu kiểm tra, chúng tôi sử dụng dung dịch chuẩn để đánh giá độ đục theo Dược điển Châu Âu (Mục 2.2.1-Clarity and degree of opalescence of liquids) [9]. Dung dịch gốc được chuẩn bị bằng cách trộn 25 ml hydrazin sulfat 10 mg/ml (Sigma) với 25 ml hexamethylenetetramin 100 mg/ml. Sau khoảng 24 giờ, 15ml dung dịch gốc được pha loãng trong 1 lít nước để trở thành dung dịch hoạt động. Dung dịch hoạt động (working solutions) được sử dụng để chuẩn bị các dung dịch chuẩn đánh số từ 1-4, các dung dịch chuẩn sau đó được xác định độ đục trên máy HANNA HI 93114, kết quả được thể hiện trong Bảng 5.
40
Bảng 5. Bảng tiêu chuẩn đánh giá độ đục của sinh phẩm Dung dịch chuẩn Dung dịch gốc (ml) Nước cất (ml) Độ đục (NTU) Đánh giá mức độ đục
1 5 95 3 Trong suốt (≤ dung dịch 1)
2 10 90 6 Đục nhẹ (≤ dung dịch 2)
3 30 70 30 Đục (≤ dung dịch 3)
4 50 50 60 Rất đục (≤ dung dịch 4)