* Cơ sở lý thuyết
Phương pháp sắc ký lỏng HPLC là phương pháp phân tách bao gồm 2 pha, trong đó pha động là chất lỏng (dịch protein cần phân tách) và pha tĩnh chứa trong cột chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được cải biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Sắc ký đảo pha RP-HPLC phân tách IL-2 nhờ vào sự khác nhau giữa tính phân cực của các phân tử protein.
* Các bước tiến hành
Mẫu IL-2 thu được sau bước phá sinh khối tế bào và xử lý thô tiền tinh chế được bổ sung TFA đến nồng độ cuối cùng là 0,1% trước khi ly tâm 13000 vòng trên phút trong 5-10 phút, thu dịch nổi. Mẫu sau đó được đưa lên cột theo chương trình đã được thiết lập.
Các thông số cơ bản của quá trình tinh chế: (i) Cột sắc ký để phân tách mẫu Bio Wide Pore C5 (10 mm x 250 mm, 10 μm) (Supelco); (ii) Thành phần đệm A và B đã nêu trên; (iii) Mẫu được đưa lên cột bằng cách bơm qua bộ phận hút mẫu; (iv) Hệ thống phát hiện mẫu sử dụng đèn quang phổ cực tím trong đó bước sóng phát hiện mẫu là 280 nm; (v) Thể tích mẫu mỗi lần hút là 200 μl; (vi) Tốc độ dòng 5 ml/phút.
35
Chương trình chạy: 5 phút đầu tiên chạy gradient từ 0 đến 20% đệm B, 10 phút tiếp theo từ phút thứ 6 đến phút thứ 15 duy trì nồng độ 90% đệm B, 5 phút còn lại từ phút thứ 16 đến phút thứ 20 duy trì nồng độ 0% đệm B.
Sau khi chương trình chạy mẫu trên hệ HPLC kết thúc, mở sắc ký đồ kết quả để phân tích và xác định độ tinh khiết của sản phẩm. Lưu ý thu mẫu trong khoảng từ phút thứ 9 đến phút 12, thu theo phân đoạn.