M Ở ĐẦU
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
3.3.2. Kết quả của các mẫu bệnh nhân có đột biến mất đoạn dạng SEA
Hình 3.1. Kết quả phân tích gen α globin mẫu bệnh nhân HBA22
Màu đỏ (bên trái): mẫu đối chứng. Màu xanh (bên phải): mẫu bệnh nhân HBA22.
Nhận xét: Tỷ lệ chiều cao đỉnh đoạn dò của bệnh nhân/mẫu đối chứng ở các đoạn dò có số thứ tự 20, 21 có giá trị gần bằng 1. Trong khi đó tỷ lệ các đoạn dò có số thứ tự 1, 2, 3, 5, 12, 14, 18, 24, 25 có giá trị xấp xỉ 0,5. Các chỉ số này phù hợp với chỉ số mong đợi về các dạng đột biến SALSA MLPA probemix P140-B4 HBA đưa ra (bảng 2.2) và chứng tỏ mẫu HBA22 có đột biến gây bệnh thalassemia dạng --SEA
47
Hình 3.2. Kết quả phân tích gen α globin mẫu bệnh nhân HBA28
Màu đỏ (bên trái): mẫu đối chứng. Màu xanh (bên phải): mẫu bệnh nhân HBA28
Nhận xét: Tỷ lệ chiều cao đỉnh đoạn dò của bệnh nhân/mẫu đối chứng ở các đoạn dò có số thứ tự 20, 21 có giá trị gần bằng 1. Trong khi đó tỷ lệ các đoạn dò có số thứ tự 1, 2, 3, 5, 12, 14, 18, 24, 25 có giá trị xấp xỉ 0,5. Các chỉ số này phù hợp với chỉ số mong đợi về các dạng đột biến SALSA MLPA probemix P140-B4 HBA đưa ra (bảng 2.2) và chứng tỏ mẫu HBA28 có đột biến gây bệnh thalassemia dạng --SEA
/αα.
Bàn luận: Theo một số nghiên cứu thì trong kết quả của kỹ thuật MLPA, mỗi một đỉnh tín hiệu (peak) thể hiện sản phẩm của một đoạn dò (khi một đoạn dò nào đó bắt cặp được với trình tự DNA đích, nối lại được thì mới được khuếch đại và xuất hiện tín hiệu). Năm 2002, Schouten J.P. nghiên cứu kỹ thuật MLPA để dò tìm đột biến mất đoạn, lặp đoạn các gen BRCA1, MSH2, MLH1, dò tìm trisomy 21 (hội chứng Down). Tác giả cho rằng sự thay đổi số lượng bản sao của trình tự đặc biệt trên nhiễm sắc thể phản ánh tình trạng bệnh lý (sự mất hoặc lặp đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể như mất, lặp một exon). Tác giả còn đưa ra cách xác định đột biến khi ứng dụng kỹ thuật MLPA là nếu exon bị mất, thì đỉnh tín hiệu (peak) sẽ giảm đi ½ so với bình thường [57]. Tác giả Loryn N.S. (2004) cũng đã trình bày về kỹ thuật MLPA để xác định đột biến mất đoạn, lặp đoạn. Trong kỹ thuật MLPA, số lượng bản sao
48
sau khi PCR, có mối liên quan với chiều cao đỉnh tín hiệu, nó cho thấy trình tự đích bị mất hay lặp đoạn [46].
Dựa vào bảng 2.2. Các dạng đột biến mất đoạn gen α globin thường gặp và tỷ lệ các đoạn dò mong đợi mà SALSA MLPA probemix P140-B4 HBA (MRC-Holland) đưa ra để xác định đột biến gen α globin dạng --SEA/αα, kết hợp với hình ảnh chiều cao các đỉnh (trong các hình: màu đỏ - bên trái là mẫu đối chứng; màu xanh - bên phải là mẫu bệnh nhân), cũng như số liệu về tỷ lệ chiều cao các đỉnh trong hình ảnh MLPA, điện di mao quản của bệnh nhân và mẫu đối chứng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định được 18 bệnh nhân có đột biến dạng --
SEA/αα. Đối với trường hợp đột biến dạng --SEA/αα ta chủ yếu chú ý đến các đoạn dò có số thứ tự 1, 2, 3, 5, 12, 14, 18, 24, 25, các đoạn dò này phải có tỷ lệ các đỉnh của bệnh nhân/đối chứng gần bằng 0,5. Trong khi các đoạn dò có số thứ tự 20 và 21 có tỷ lệ các đỉnh bệnh nhân/đối chứng gần bằng 1. Đoạn dò số 24 và 25 giúp khảo sát exon 1, exon 3 trên cả hai gen HBA1, HBA2 nên tỷ lệ của chúng trong trường hợp đột biến --SEA/αα gần bằng 0,5. Đột biến dạng --
SEA/αα là đột biến mất đoạn dài khoảng 20,5 kb làm mất cả 2 gen α globin trên cùng alen và một số vùng xung quanh 2 gen này (hình 1.9) [19], do vậy các đoạn dò tương ứng không bắt cặp được với vùng gen bị mất sẽ thể hiện tỷ lệ các đỉnh gần bằng 0,5. Phân tích tỷ lệ chiều cao đỉnh bệnh nhân/đối chứng ở các đoạn dò bắt cặp với những gen tham khảo (reference probes), ta thấy tỷ lệ đỉnh tín hiệu bệnh nhân/đối chứng nằm trong khoảng 0,8 - 1,2; không có hiện tượng hình ảnh bị “bôi đen” ở bảng số liệu tính tỷ lệ các đỉnh, điều đó chứng tỏ kết quả là đáng tin cậy và việc xác định kết quả dạng đột biến --SEA/αα gây bệnh α thalassemia mà bệnh nhân mắc phải phù hợp với triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng xuất hiện ở bệnh nhân (hồng cầu nhỏ, nhược sắc, thiếu máu nhẹ). Kết quả của nghiên cứu này cũng tương tự như nghiên cứu của Liu J.Z. và cộng sự (2008) về ứng dụng kỹ thuật MLPA để phát hiện bệnh α thalassemia ở Trung Quốc, các tác giả chỉ ra rằng khi đoạn dò tìm trình tự hiện diện trên cả 2 gen HBA1 và HBA2 có tín hiệu giảm đi 50% thì mẫu đó bị đột biến mất 2 gen và phải kết hợp với tỷ lệ các đoạn dò khác nếu tỷ lệ giảm 50% thì cho phép ta xác định mẫu đó có đột biến dạng --SEA/αα.
49