M Ở ĐẦU
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
2.4.1. Tách chiết DNA từ mẫu máu ngoại vi
Máu tươi được chống đông bằng EDTA, được tách trong vòng 24 giờ. Quy trình tách chiết DNA từ 200 μl máu ngoại vi được tiến hành theo QIAGEN Kit.
Nguyên tắc tách chiết: Tế bào máu ngoại vi sẽ được phân giải bằng dung dịch AL. Dung dịch phân giải có chứa DNA được cho qua cột lọc, DNA sẽ được giữ lại trên màng lọc silica. Sau khi rửa nhiều lần, DNA sẽ được thu nhận bằng cách giải hấp thụ với AE, lưu trữ và bảo quản để sử dụng [74].
Tách chiết DNA
Thực hiện các bước của phản ứng MLPA
Điện di mao quản GenomeLab GeXP (Beckman Coulter)
Phân tích kết quả và xác định dạng đột biến Mẫu nghiên cứu
Bảo quản
33
Bước 1. Ta dùng pipet, hút 20 μl QIAGEN protease (hay proteinase K) cho vào tube 1,5 ml. Cho 200 μl dung dịch mẫu (máu toàn phần, vortex cho mẫu đều) vào tube có chứa protease trên, thêm 200 µl Buffer AL. Sau đó, đem tube đi vortex trong 15 giây.
Bước 2. Ủ tube ở 56OC /10 phút. Spin 5 giây.
Bước 3. Thêm 200 μl Ethanol (96 - 100%) vào tube, vortex 15giây, spin 5giây
Bước 4. Chuyển tất cả hỗn hợp trong tube sang cột lọc chứa trong tube (2 ml). Ly tâm 8.000 vòng/ 1 phút.
Bước 5. Chuyển cột sang tube (2 ml) mới
Bước 6. Hút 500 µl Buffer AW1 cho vào cột lọc, sau đó quay ly tâm 8.000 vòng/ 1 phút.
Bước 6. Chuyển cột sang tube 2 ml mới.
Bước 7. Hút 500µl Buffer AW2 cho vào cột lọc, sau đó quay ly tâm 14.000 vòng/ 3 phút.
Bước 8. Chuyển cột sang tube (2 ml) mới, quay ly tâm 14.000 vòng/1 phút.
Bước 9. Chuyển sang cột thu (1,5 ml). Thêm 200 µl Buffer AE, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút . Ly tâm 8.000 vòng /1 phút.
Bước 10. Thu DNA và bảo quản ở nhiệt độ -200
C.
Sử dụng bộ kit tách chiết QIAamp blood mini kit của hãng QIAGEN (Mỹ). Đây là bộ kit cho phép tách chiết DNA có độ tinh sạch cao. Thành phần của bộ kit được trình bày trong bảng 2.1 và sơ đồ tóm tắt quy trình tách chiết DNA được trình bày trong hình 2.2.
Bảng 2.1. Thành phần kit tách chiết QIAamp DNA Blood minikit QIAGEN
Thành phần Chức năng
Cột lọc QIAamp Giữ DNA
Protein K Biến tính protein
Dung dịch giải AL Ly giải tế bào
Dung dịch rửa AW1 Rửa DNA lần 1
Dung dịch rửa AW2 Rửa DNA lần 2
34
Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi bằng kit QIAGEN 2.4.2. Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA
Đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA, những mẫu có giá trị tỷ lệ về mật độ quang đo ở bước sóng 260/280 đạt 1,8 - 2,0 mới được sử dụng để tiến hành phản ứng MLPA.
Nguyên tắc để xác định nồng độ acid nucleic (DNA) là dựa vào giá trị mật độ quang OD như sau: dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260 nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương quan sau: Một đơn vị OD260 nm tương ứng với một nồng độ là:
50 μg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi.
40 μg/ml cho một dung dịch DNA hay RNA sợi đơn. Hàm lượng DNA được xác định bằng công thức: [DNA] = OD260 x 50 (μg)
Phương pháp này đơn giản, nhanh, nhưng có hạn chế là giá trị đọc được về độ hấp thụ có thể bị ảnh hưởng khi trong mẫu không sạch (chứa RNA và protein). Vì vậy, trong thực tế phương pháp này thường được dùng để định lượng các mẫu DNA có độ tinh sạch đạt yêu cầu.
Protein hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 280 nm do sự hấp thụ của các acid amin, đo giá trị mật độ quang OD ở bước sóng 280 nm. Độ sạch của DNA được xác định bằng tỷ số OD260/ OD280. Nếu tỷ số này 1,8 - 2,0 thì dung dịch DNA đem đo được coi là sạch.
35
Cách đo: Đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy Nanodrop 2000/2000c (tại phòng thí nghiệm của trung tâm Kiểm chuẩn xét nghiệm Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh).
Bước 1. Mở máy tính và phần mềm ứng dụng dùng đo OD: Nanodrop nhấn “Acid nucleic”.
Bước 2. Dùng 2 μl nước làm mẫu trắng. Khi đo nước, nhấn nút “Blank”, đưa các thông số về giá trị 0. Lưu ý, sau mỗi lần đo xong phải lau sạch nước hoặc dung dịch mẫu.
Bước 3. Hút dung dịch DNA (2 μl), cho vào máy và nhấn nút “Measure”, ghi lại kết quả nồng độ và độ tinh sạch của mẫu DNA.
2.4.3. Tiến hành kỹ thuật MLPA
Sử dụng Kit SALSA MLPA P140 HBA probemix (MRC - Holland) chứa các đoạn dò lai đặc hiệu với các vùng trên gen α globin, ngoài ra còn các đoạn nội chuẩn (đoạn gen tham khảo) giúp kiểm chuẩn phản ứng MLPA. Các đoạn dò được thiết kế với trình tự acid nucleic giống nhau ở hai đầu gắn mồi, do vậy chỉ cần sử dụng 1 cặp mồi duy nhất để khuếch đại toàn bộ các đoạn dò chứa trong hỗn hợp thuốc thử, như vậy có thể khảo sát nhiều vùng gen α globin khác nhau. Quy trình phản ứng MLPA như sau
(1) Loại bỏ RNA (cần thiết cho phản ứng xác định đột biến gen α globin ) và giai đoạn biến tính
Lấy 4 μl mẫu DNA (có tổng lượng DNA là 100 ng) cho vào tube 0,2 ml, sau đó cho 1 μl RNAse vào để hủy RNA, spin. Cho vào máy PCR, ủ 370
C trong 30 phút. Biến tính DNA ở 980C trong 5 phút.
(2)Phản ứng lai (bước này khi thực hiện có thể lấy tube ra ngoài)
Thêm 3 μl hỗn hợp hybridisation master mix vào mỗi tube phản ứng gồm 1,5 μl dung dịch MLPA buffer và 1,5 μl MLPA probemix, trộn dung dịch đều, tiếp tục chu trình nhiệt ở 95oC trong 1 phút, sau đó lai hóa (ủ) ở 60o
C trong 16h – 20h (qua đêm).
(3) Phản ứng nối
Thêm 32 μl hỗn hợp Ligase-65 master mix (gồm 25 μl dH2O, 3 μl Ligase buffer A, 3 μl Ligase buffer B, 1 μl enzyme Ligase-65) vào mỗi tube phản ứng, trộn đều và ủ ở 54o
C trong 15 phút để nối các đoạn dò, sau đó tăng nhiệt độ lên 98oC trong 5 phút để phá hủy enzym ligase và tiến hành thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn dò (sau gắn hoàn thiện 2 đoạn dò xuôi và ngược với nhau).
36
(4) Phản ứng PCR (khuếch đại các đoạn dò)
Thêm vào mỗi tube trên 10 μl hỗn hợp polymerase master mix gồm 7,5 μl dH2O, 2 μl SALSA PCR primermix và 0,5 μl SALSA polymerase (giữ trong lòng bàn tay 10 giây để làm giảm độ nhớt) và tiến hành phản ứng PCR. Chu kỳ nhiệt: 95°C trong 30 giây, 60°C trong 30 giây, 72°C trong 60 giây, lặp lại 35 chu kỳ. Sau đó kéo dài kết thúc ở 72oC trong 20 phút. Cuối cùng, nhiệt độ được hạ xuống còn 4o
C. Các primer có gắn huỳnh quang nên khi điện di sản phẩm PCR trên máy điện di mao quản sẽ xuất hiện màu theo quy định của hãng hóa chất.
(5) Điện di mao quản: sản phẩm sau khi khuếch đại được phân tách đoạn trên hệ thống điện di mao quản GenomeLab GeXP (Beckman Coulter) ở điều kiện: 32 μl dung dịch sample loading solution (formamide) + 0,2 μl Beckman D1-labeled CEQ size standard 600 + 1 μl sản phẩm PCR; nhiệt độ mao quản là 500C, biến tính 900C trong 20 giây, điện thế bơm mẫu vào 1,6 kV trong 30 giây, điện thế phân tách đoạn 4,8 kV trong 60 phút.
(6) Phân tích kết quả: kết quả sau khi chạy điện di sẽ được phân tích tự động để tìm đột biến mất đoạn gen α globin nhờ vào phần mềm GeneMarker version 1.97 (Softgenetics, State College, PA). Kết quả sẽ được hiển thị dưới dạng bảng và dạng biểu đồ sóng (electropherogram).
Trong kết quả của kỹ thuật MLPA, mỗi một đỉnh tín hiệu (peak) thể hiện sản phẩm của một đoạn dò (khi một đoạn dò nào đó bắt cặp được với trình tự DNA đích, nối lại được thì mới được khuếch đại và xuất hiện tín hiệu) [57]. Chiều cao của mỗi peak cho thấy sự liên quan với số lượng bản sao (copy) của trình tự DNA bổ sung với đoạn dò [48], phản ánh nồng độ của chúng (hay nồng độ đoạn gen tương ứng gắn với đoạn dò) trong sản phẩm PCR. Từ đó chiều cao đoạn dò của mẫu bệnh nhân được so sánh với mẫu đối chứng (người bình thường) để phát hiện đột biến mất đoạn gen α globin. Trường hợp bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn gen α globin thì tỷ lệ chiều cao đỉnh đoạn dò tương ứng của bệnh nhân/mẫu đối chứng xấp xỉ bằng 1. Nếu bệnh nhân bị đột biến mất đoạn cả 2 cặp gen α globin thì không có hiện tượng lai đoạn dò, không tạo thành đoạn dò hoàn chỉnh và đoạn dò đó sẽ không được khuếch đại, do đó khi điện di mao quản sẽ không thấy xuất hiện đỉnh của đoạn dò. Tuy nhiên, đột biến này thường không gặp trong thực tế vì thai chết lưu trong tử cung. Theo MRC - Holland thì SALSA MLPA probemix được thiết kế để dò tìm đột biến mất đoạn và lặp đoạn của một hay nhiều trình tự ở trong hoặc gần các gen HBA1, HBA2 (α1, α2). Đoạn dò 142 và 166 nt dò tìm trình tự exon 1, 3 ở cả hai gen HBA1, HBA2 nên tín
37
hiệu chỉ giảm 20 - 25% ở những mẫu bị đột biến mất 1 gen trong 2 cặp gen α globin. Các dạng đột biến mất đoạn gen α globin khác nhau sẽ cho tỷ lệ các đoạn dò 142, 166 nt có giá trị thay đổi như sau: nếu đột biến mất đoạn dị hợp -α3,7
, -α 4,2
(mất 1 gen trong 2 cặp gen α globin) thì tỷ lệ chiều cao của đoạn dò mẫu bệnh nhân/mẫu chứng xấp xỉ 0,75 (khoảng 0,75 - 0,8), nếu là đột biến mất đoạn đồng hợp -α3,7, -α 4,2 (mất 2 gen trong 2 cặp gen α globin) thì tỷ lệ chiều cao của đoạn dò xấp xỉ 0,5 (khoảng 0,5 - 0,65), nếu đột biến mất 3 gen trong 2 cặp gen α globin thì tỷ lệ chiều cao của đoạn dò là khoảng 0,25, nếu là lặp đoạn thì tỷ lệ chiều cao của đoạn dò là khoảng 1,2.
Ngoài việc căn cứ vào tỷ lệ của đoạn dò 142, 166 nt, ta còn căn cứ thêm tỷ lệ chiều cao của một số đoạn dò khác (tỷ lệ các đoạn dò mong đợi) mà MRC - Holland đưa ra để xác định các dạng đột biến mất đoạn gen α globin thường gặp (bảng 2.2).
Bảng 2.2. Các dạng đột biến mất đoạn gen α globin thường gặp và tỷ lệ các đoạn dò mong đợi
Probe name Độ dài (nt) Bình thường -α3,7 / αα -α3,7 / -α3,7 -α4,2 / αα --SEA/ αα -α3,7 / --SEA POLR3K gene 04913-L01316 236 1 1 1 1 1 1 HS-40 (1) 04799 - L04797 178 1 1 1 1 1 1 HS-40 (2) 04800 - L04175 382 1 1 1 1 1 1 9.3 kb upstream HBZ 04926 - L18352 364 1 1 1 1 1 1 3.5 kb upstream HBZ 04622 - L04001 346 1 1 1 1 1 1 HBZ/HBZP (1) 04624-L04004 292 1 1 1 1 1 1 HBZ/HBZP (2) 04625-L04005 318 1 1 1 1 1 1 HBA2P/HBA1P 04637-L04018 184 1 1 1 1 0,5 0,5 HBA1P/HBA2 (1) 08488-L08410 373 1 1 1 0,5 0,5 0,5 HBA1P/HBA2 (2) 202 1 1 1 0,5 0,5 0,5
38 04627-L04007 HBA1P/HBA2 (3) 08492 - L08415 214 1 1 1 0,5 0,5 0,5 HBA1P/HBA2 (4) 04628 - L04008 229 1 1 1 0,5 0,5 0,5 HBA2 int2 (1) 08498-L08422 160 1 0,5 0 0,5 0,5 0 HBA2 int2 (2) 04633-L06249 241 1 0,5 0 0,5 0,5 0 HBA2 Ex3 08491- L08414 196 1 0,5 0 0,5 0,5 0 HBA2/HBA1 (1) 04626-L04740 190 1 0,5 0 1 0,5 0 HBA2/HBA1 (2) 08493-L08416 220 1 0,5 0 1 0,5 0 HBA2/HBA1 (3) 08494-L08417 256 1 0,5 0 1 0,5 0 HBA2/HBA1 (4) 08497-L08420 337 1 0,5 0 1 0,5 0 HBA1+2, exon1 04630-L04011 142 1 0,75 0,5 0,75 0,5 0,25 HBA1+2, exon3 04632-L06292 166 1 0,75 0,5 0,75 0,5 0,25 HBA region 0.2 kb downstream HBA1 08499-L08423 154 1 1 1 1 0,5 0,5 HBA region 0,5 kb downstream HBA1 04638-L04019 283 1 1 1 1 0,5 0,5 HBA region 2.4 kb downstream HBA1 04639-L04020 310 1 1 1 1 0,5 0,5 HBQ1 3,7 kb downstream HBA1 06707-L06294 400 1 1 1 1 0,5 0,5 HBA S00290- L09493 Constant Spring
39
Hình 2.3. Biểu đồ thể hiện vị trí của các đoạn dò trong P140-B4 HBA MLPA probemix
Các số liệu phía trên các mũi tên thể hiện kích thước khuếch đại của các đoạn dò. Đoạn dò 142 nt và 166 nt dò tìm trình tự hiện diện trên cả hai gen HbA1 và HbA2 [73].
Nhận xét:Dựa vào biểu đồ thể hiện vị trí của các đoạn dò (hình 2.3) và bảng các dạng đột biến mất đoạn gen α globin thường gặp và tỷ lệ các đoạn dò mong đợi (bảng 2.2). Ta thấy rằng, kết quả MLPA và điện di mao quản là đáng tin cậy khi tỷ lệ đỉnh tín hiệu của mẫu bệnh nhân/đối chứng ở các đoạn dò phải có giá trị gần bằng với đa số các giá trị mà protocol của MRC - Holland đưa ra, tín hiệu của các đoạn dò ở những exon gần kề nhau (ví dụ như 2 đoạn dò tìm 2 exon trên cùng 1 gen α globin) đều phải có tín hiệu cùng tăng hay cùng giảm, chứ không phải tín hiệu này tăng, còn tín hiệu kia thì giảm. Ngoài ra, theo MRC - Holland thì khi khảo sát hình ảnh thể hiện tỷ lệ đỉnh bệnh nhân/đối chứng, ta thấy các đoạn dò bắt cặp với các đoạn gen tham khảo (reference probes) đều xuất hiện tỷ lệ đỉnh tín hiệu tương ứng nằm trong khoảng 0,8 - 1,2 thì chứng tỏ kết quả là đáng tin cậy. Kết quả MLPA không mang tính xác thực khi tín hiệu của các đoạn dò ở những exon gần kề nhau tăng hay giảm bất thường; trong cùng một mẫu thí nghiệm mà tỷ lệ đỉnh tín hiệu của mẫu bệnh nhân/đối chứng ở đa số các đoạn dò có giá trị khác với các giá trị mà protocol của MRC - Holland đưa ra.
40
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò đặc hiệu
Sử dụng kỹ thuật MLPA (kit SALSA MLPA probemix P140-B4 HBA Beckman Coulter Genomelab GeXP) để tiến hành phân tích 30 mẫu DNA tách chiết từ 30 người bình thường, sau đó thu thập tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò để thiết lập nên thang chuẩn phù hợp cho hệ thống GenomeLab GeXP (Beckman Coulter). Tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò đặc hiệu exon được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò đặc hiệu SALSA MLPA PROBE (PROBE NAME) VÙNG GEN HIỆU CHỈNH TÍN HIỆU CỦA CÁC ĐOẠN DÒ Trước (theo
protocol của hãng) Sau
08499-L08423 0,2 kb downstream HBA1 154,0 154,0 04638-L04019 0,5 kb downstream HBA1 283,0 283,0 04639-L04020 2,4 kb downstream HBA1 310,0 310,0 04622-L04001 3,5 kb upstream HBZ 346,0 346,0 06707-L06294 HBQ1, 3,7 kb downstream HBA1 400,0 400,0 04913-L01316 POLR3K gen 236,0 236,0 04926-L18352 9,3 kb upstream HBZ 364,0 364,0 08493-L08416 HBA2/HBA1(2) 220,0 220,0 04628-L04008 HBA1P/HBA2(4) 229,0 229,0 04627-L04007 HBA1P/HBA2(2) 202,0 202,0 08492-L08415 HBA1P/HBA2(3) 214,0 214,0 08488-L08410 HBA1P/HBA2(1) 373,0 373,0 08494-L08417 HBA2/HBA1(3) 256,0 256,0 04626-L04740 HBA2/HBA1(1) 190,0 190,0 04637-L04018 HBA2P/HBA1P 184,0 184,0 08497-L08420 HBA2/HBA1(4) 337,0 337,0
41 04625-L04005 HBZ/HBZP(2) 318,0 318,0 04624-L04004 HBZ/HBZP(1) 292,0 290,0 CREBBP 03085- L04948 Centromeric HBA1 325,0 325,0 08491-L08414 Kết thúc exon 3 của HBA2 196,0 196,0 04630-L04011 HBA1+2, exon 1 142,0 142,0 04632-L06292 HBA1+2, exon 3 166,0 166,0 08498-L08422 HBA2 intron 2 (1) 160,0 160,0 04633-L06249 HBA2 inton 2 (2) 241,0 241,0 04800-L04175 HS-40 (2) 382,0 382,0 04799-L04797 HS-40 (1) 178,0 178,0 Reference probe 01701-L01469 5q22 391,0 391,0 Reference probe 03255-L02692 11p13 301,0 301,0 Reference probe 00547-L00116 11q22 355,0 355,0 Reference probe 02020-L01539 15q11 172,0 172,0 Reference probe 02813-L02242 17q21 208,0 208,0 Reference probe 02869-L02336 1p21 247,0 247,0 Reference probe 03272-L02709 3q29 409,0 409,0 Reference probe 03075-L02475 5p15 265,0 265,0 Reference probe 01542-L00985 5q22 274,0 274,0
42 Reference probe 00797-L00463 5q31 130,0 130,0 Reference probe 03707-L03161 9q22 148,0 148,0 X-fragment Nhiễm sắc thể X 100,0 100,0 Y-fragment Nhiễm sắc thể Y 105,0 105,0
Nhận xét: Bảng 3.1 mô tả tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò đặc hiệu, ta thấy đa số tín hiệu của thang chuẩn (sau khi hiệu chỉnh) phù hợp với hệ thống tín hiệu theo protocol của hãng MRC - Holland (trước khi hiệu chỉnh). Chỉ có tín hiệu của đoạn dò 04624-L04004 dò tìm vùng gen HBZ/HBZB(1) có tín hiệu sau khi hiệu chỉnh là 290 bp so với trước khi hiệu chỉnh là 292 bp. Sự khác biệt đó là do khi chạy phản ứng MLPA tín hiệu các đoạn dò