- Tỷ lệ quả 3 hạt: Tỷ lệ quả 3 hạt/cây phụ thuộc vào đặc tính di truyền của từng giống, các giống đậu tương khác nhau sẽ có tỷ lệ quả 3 h ạ t khác
3.3.2 Sử dụng chỉ thị SSR khảo sát nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt
Ở đậu tương, biểu hiện tính kháng của cây là vết bệnh màu nâu đỏ (RB), không bào tử hoặc chỉ một vài bào tử. Nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt Châu Á được công bố hiện nay gồm 6 gen chính là Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5 . Các gen này đã được lập bản đồ liên kết với các nhóm khác nhau như Rpp1 nằm trong nhóm liên kết (LG) G( Hyten el al., 2007), Rpp3 liên kết nhóm gen LGC2 (Hyten el al., 2009); Rpp2 và Rpp4 nằm trong nhóm liên kết LGJ và G( Silva el al., 2008; Yamaaka et al., 2008) và Rpp5 liên kết nhóm LGC( Garcia et al., 2008).
Theo nghiên cứu của Hyten et al. (2007) phân tích gen Rpp1 giữa hai chỉ thị SSR là Sct_187 và Sat-064 nằm tren nhóm liên kết G. Các chỉ thị SSR
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 Sat_255 và Satt620 liên kết với gen Rpp2 với khoảng cách di truyền là 43,85cM và 53,71 cM ( Silva et al., 2008); Satt288 và AF16228 nằm nhóm liên kết G liên với gen Rpp4 với khoảng cách di truyền là 76,77 cM và 86,94 cM (Yamanaka et al., 2008). Những nghiên cứu các năm tiếp theo cũng chỉ ra một số chỉ thị SSR liên kết với Rpp3 như Satt640 và Satt263... Đây là những chỉ thị SSR đã được nghiên cứu và đánh giá và được lựa chọn là chỉ thị trong đánh giá giống kháng bệnh gỉ sắt trên cây đậu tương.
Dựa trên những nghiên cứu trên chúng tôi thu thập và chọn lọc chỉ thị để đánh giá nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt trên cây đậu tương. Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn 10 chỉ thị SSR là: Sct_187; Sat-064; Sat_255; Satt620; Satt460; Satt134; Satt263; Satt 288; Sat_275; Sat_ 280 để khảo sát nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt đậu tương.
Chúng tôi tiến hành chạy PCR với 10 chỉ thị SSR. Kết quả phân tích sản phẩm PCR được tiến hành trên máy điện di mao quản QIAxel. Kết quả quan sát cho thấy 10 chỉ thị SSR cho sản phẩm khuếch đại đạt 75% mẫu, số lượng các đoạn DNA tạo ra cho đa hình ở các mức độ khác nhau.
Kết quả chạy PCR đối với chỉ thị Satt134 cho sản phẩm khuếch đại DNA đạt 10 %, do vậy chỉ thị này hoạt động không ổn định, nên không sử dụng được trong đánh giá nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt
Hình 3.1. Chỉ thị Sat143
Sat143: Giếng 1: Marker;2:Đ/c dương;3: Đ/c âm(V74); 4: Dòng 7; 5: OMDN112;6: DT96; 7: Cúc BH nâu; 8: Như khê; 9: DT95; 10: MAC 01; 11: Dòng 1OT;12: Cao Bằng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65
Hình 3.2. Chỉ thị Sat_275
Sat_275: Giếng 1: Marker;2: Đc dương; 3: Đ/c âm(V74);4: Dòng 7; 5: OMDN112;6: DT96; 7: Cúc BH nâu; 8: Như khê; 9: DT95; 10: MAC 01; 11: Dòng 1OT;12: Cao Bằng.
Đối với chỉ thị Sat_263; Sat_275 sản phẩm khếch đại DNA cho sản phẩm đạt 90% , tuy nhiên lại không phân biệt đa hình với đối cặp đối chứng trong đó đối chứng âm và dương cho vạch band kích thước phân tử tương đương nhau: chỉ thị Sat_263 kích thước sản phẩm PCR của đối chứng âm và dương là 120 bp; chỉ thị Sat_275 kích thước sản phẩm PCR duy nhất là 250 bp. Như vậy, độ chính xác của hai chỉ thị trên không cao trong việc đánh giá gen kháng – nhiễm bệnh gỉ sắt trên cây đậu tương.
Các chỉ thị Sat-064; Satt620; Sat_ 255; Satt460; Satt288; Sat_280; Sct_187 cho đa hình đối với cặp đối chứng là cơ sở đánh giá nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66
Hình 3.3. Chỉ thị Sat-064
Sat-064: Giếng 1: Marker;2: Đ/c dương: PI200492 (Rpp1); 3: Đ/c âm(V74); 4: Dòng 7; 5: OMDN112;6: DT96; 7: Cúc BH nâu; 8: Như khê; 9: DT95; 10: MAC 01; 11: Dòng 1OT;12: Cao Bằng
Hình 3.4.Chỉ thị Sct_187
Sct_187: Giếng 1: Marker;2: Đ/c dương: PI200492 (Rpp1); 3: Đ/c âm(V74); 4: Dòng 7; 5: OMDN112;6: DT96; 7: Cúc BH nâu; 8: Như khê; 9: DT95; 10: MAC 01; 11: Dòng 1OT;12: Cao Bằng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67
Hình 3.5. Chỉ thị Sat_280
Sat_280: Giếng 1: Marker;2: Đ/c dương; 3: Đ/c âm(V74); 4: Dòng 7; 5: OMDN112;6: DT96; 7: Cúc BH nâu; 8: Như khê; 9: DT95; 10: MAC 01; 11: Dòng 1OT;12: Cao Bằng
Hình 3.6. Chỉ thị Sat_255
Sat_255:Giếng 1: Marker;2: Đ/c dương; 3: Đ/c âm(V74); 4: Dòng 7; 5: OMDN112;6: DT96; 7: Cúc BH nâu; 8: Như khê; 9: DT95; 10: MAC 01; 11: Dòng 1OT;12: Cao Bằng
Chỉ thị Sat- 064; Sct_187; Sat_280; Sat_255 ghi nhận 96% sản phẩm được khuếch đại DNA và cho đa hình. Chỉ thị Sat- 064 cho sản phẩm kích thước phân tử chênh lệch với mức độ 110bp và 135 bp. Chỉ thị Sct_ 187 cho sản phẩm kích thước các phân tử tương ứng là 145 bp và 158 bp; chỉ thị Sat
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 _280 tương ứng là 245 bp và 285bp... Nếu so sánh sản phẩm của chỉ thị phân tử trên các giống thì ghi nhận đa hình rất rõ. Sản phẩn chia thành hai vạnh band A và B , kích thước có vị trí phân tử thấp là các giống mang gen nhiễm (kích thước band 113 bp đối với chỉ thị Sat- 064 và 146 bp đối với Sct_187; 245 bp đối với Sat_280; 245 bp đối với Sat_255) và ngược lại là vị trí phân tử của giống mang gen kháng có kích thước lớn hơn (134bp đối với Sat-064 và 157bp đối với Sct- 187; 285bp đối với Sat_280; 300 bp đối với Sat_255) .
Hình 3.7. Chỉ thị Satt288
Satt288: Giếng 1: Marker;2: Đ/c dương;3: Đ/c âm(V74); 4: Dòng 7; 5: OMDN112;6: DT96; 7: Cúc BH nâu; 8: Như khê; 9: DT95; 10: MAC 01; 11: Dòng 1OT; 12: Cao Bằng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 69
Sat460: Giếng 1: Marker;2: Đ/c âm(V74); 3: Đ/c dương;4: Dòng 7; 5: OMDN112;6: DT96; 7: Cúc BH nâu; 8: Như khê; 9: DT95; 10: MAC 01; 11: Dòng 1OT;12: Cao Bằng
Hình 3.9. Chỉ thị Satt620
Sat620: Giếng 1: Marker;2: Đ/c âm(V74); 3: Đ/c dương; 4: Dòng 7; 5: OMDN112;6: DT96; 7: Cúc BH nâu; 8: Như khê; 9: DT95; 10: MAC 01; 11: Dòng 1OT; 12: Cao Bằng
Đối với chỉ thị Satt 620, Satt 460; Satt288 ghi nhận 96% sản phẩm được khuếch đại và các sản phẩm đa hình phân biệt với kích thước phân tử. Tuy nhiên sự khác biệt giữa giống mang gen kháng và nhiễm lại ngược lại với các chỉ thị trên. Trong đó kích thước ở vị trí phân tử thấp hơn là giống mang gen kháng (300 bp đối với Satt 620 và 130 bp đối với Satt460; 200 bp đối với Satt288) và ngược lại là giống có gen nhiễm có kích thước lớn hơn (320pb đối với Satt620 và 170bp đối với Satt460; 250 bp đối với Satt288).
Như vậy, Khảo sát 10 chỉ thị SSR thu được kết quả sau:
- Chi thị Satt134 hoạt động không ổn định; chỉ thị Sat_263; Sat_275 không phân biệt đa hình đối với cặp đối chứng(âm và dương) nên không có độ chính xác cao trong đánh giá và khảo sát nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt.
- Chỉ thị Sat-064; Satt620; Sat_ 255; Satt460; Sct_187; Satt288; Sat_280 cho đa hình đối với cặp đối chứng là cơ sở đánh giá nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 70
Bảng 3.7. Kết quả chạy 10 chỉ thị SSR khảo sát nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt trên cây đậu tương STT Tên dòng, giống
Khả năng chứa gen kháng
Rpp1 Rpp2 Rpp3 Rpp4 Rpp5
Sct_
187 Sat_ 064 Satt 620 _255 Sat Satt 460 Satt 134 _263 Sat Satt 288 Sat_ 275 Sat_ 280
1 Dòng 7 + + + + + 2 OMDN112 + + 3 DT96 + 4 Cúc BH nâu + 5 Như khê + + + + + 6 DT 95 + + 7 MAC 01 8 Dòng 1 OT + 9 Cao Bằng + + + + + 10 ĐT26 + + 11 HL203 + + 12 CLVR 64 + + + 13 ĐT12 14 DT 2001 + + + 15 DT84 16 HL07-15 + 17 Chandra + + + + 18 ĐT2000 + + + + + 19 ĐVN12
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71
STT Tên dòng, giống
Khả năng chứa gen kháng
Rpp1 Rpp2 Rpp3 Rpp4 Rpp5
Sct_
187 Sat_ 064 Satt 620 _255 Sat Satt 460 Satt 134 _263 Sat Satt 288 Sat_ 275 Sat_ 280
20 DT2007 21 ĐH4B + + 22 LS16 + + 23 T287008 + + 24 TL 2901 + 25 Đ8 + 26 AK03 27 VX-1 + + 28 Nhất tiến HLLS + + + + + + 29 M103 Đ/c âm V74 Đ/c dương PI200492 (Rpp1) + + Đ/c dương PI230970 (Rpp2) + + Đ/c dương PI462312 (Rpp3) + Đ/c dương PI459025B (Rpp4) + Đ/c dương PI200256 (Rpp5) + Tổng cộng 8 9 9 10 7 7 15
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 - Kết quảđánh giá các dòng vật liệu như sau: Chỉ thị Sct_187 phát hiện được 8 giống mang gen Rpp1; Chỉ thị Sat-064 phát hiện được 9 giống mang gen kháng Rpp1. Như vậy, có 17 dòng, giống được kiểm tra có mang gen Rpp1. Chỉ thị Satt620 cho sản phẩm gồm 9 dòng mang gen Rpp2; chỉ thị Sat_255 có 10 giống có gen Rpp2. Có 19 dòng , giống được đánh giá mang gen Rpp2. Chỉ thị Satt288 có 7 giống có chứa gen Rpp4, tương đương có 7 dòng, giống mang gen Rpp4. 15 dòng, giống mang gen Rpp5 được phát hiện bởi chỉ thị Sat_ 280.