H. 1(F) Phakopsora pachyrhizi: Vết bệnh RB không có bào tử.
1.2.5 Gen qui định tính kháng bệnh gỉ sắt đậu tương và chỉ thị phân tử
Nghiên cứu đậu tương kháng bệnh gỉ sắt đã được tiến hành từ nhiều năm nay ở nhiều nước trên thế giới, tuy nhiên số giống kháng được phát hiện là rất ít. Ở Đài Loan chỉ có 2 giống kháng trong hàng trăm mẫu giống được thử nghiệm tại Mỹ (Browfield, 1980; Green, 1984). Ở Mỹ có 2 mẫu giống trong 110 mẫu giống địa phương có phản ứng RB với cả 4 nguồn bệnh từ Australia, India, Đài Loan và Tuerto Rico. Việt Nam có 5 giống trong 400 giống địa phương và nhập nội đánh giá với nguồn bệnh tại Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, đã phát hiện giống đậu tương ĐT 2000 kháng cao với gỉ sắt có thời gian sinh trưởng 110 – 120 ngày và được đưa vào làm đối chứng kháng trong các thí nghiệm quốc tế (N.T.Bình 2005). CIP và ở nhiều nước trên thế giới đã áp dụng phương pháp sinh học phân tử để phân tích đa dạng của quần thể ký sinh và đa dạng nguồn gen cây trồng. Bằng công nghệ sinh học trường đại học Illinois đã xác định được 9 nòi nấm gỉ sắt đậu tương.
Để xác định nguồn gen kháng trong đậu tương , Miles et al.(2006) đã đánh giá toàn bộ tế bào mần trong 16000 dòng, giống của Hoa Kỳ ( Bộ Nông
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17 nghiệp (USDA)) với một hỗn hợp gồm 5 chủng P. pachyrhizi được phân lập. Sau hai vòng đánh giá chỉ có 850 dòng, giống được xác định có khả năng chống chịu một phần hoặc phản ứng kháng với P. pachyrhizi, tương ứng dưới 5% toàn bộ nguồn gen của USDA. Các alen kháng khác nhau được mô tả trong một số tài liệu và cũng xác định được một số kiểu gen kháng (Laperuta et al. 2008, Pierozzi et al. 2008). Tính chống chịu một phần bệnh gỉ sắt đã được mô tả. Tính chống chịu ở đây được định nghĩa là khả năng cho năng suất tương đối của cây dưới áp lực của bệnh gỉ sắt. Đây là một kháng thể kiểm soát bởi nhóm gen nhỏ, có thể thể hiện như làm giảm số lượng và kích thước của bào tử, giảm sự phát triển của bào tử theo thời gian và các thành phần khác liên quan đến quá trình sản sinh bào tử. Gần đây, các nghiên cứu về giảm lượng bào tử trong mỗi hạ bào tử và đường kính của trung bình bào tử là một phần tính kháng đối với bệnh gỉ sắt đậu tương và phản ánh của sự phát triển của nấm trên mô của ký chủ (Bonde et al. 2006).
Theo các kết quả nghiên cứu trên thế giới, tính kháng bệnh gỉ sắt đậu tương Châu Á đã được xác định là di truyền bởi các gen đơn trội Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5 (Bromfield và Hartwig et al., 1980; McLean và Byth et al., 1980; Hartwig và Bromfield 1983; Hartwig et al.,1986; Garcia et al. 2008). Phần lớn các gen này đều được lập bản đồ và xác định các chỉ thị phân tử liên kết.
Các gen kháng nấm gỉ sắt châu Á (Rpp) đã được mô tả và lập bản đồ trên nhiễm sắc thể đậu tương (Chr) trong đó Rpp1 trên nhiễm sắc thể 18, Rpp2 trên nhiễm sắc thể 16, Rpp3 trên nhiễm sắc thể 6, Rpp4 trên Chr 18 và Rpp5 trên Chr 3 (Hyten et al. (2007); Garcia et al. (2008); Silva et al. (2008); Hyten et al. 2009). Ngoài ra, một số gen được phát hiện như Rpp1b trên Chr18, trong khi đó Rpp Hyuuga cũng được tìm thấy trên Chr8 (Monteros et al. 2007, Chakraborty 2009). Do tính biến chủng của loài nấm P. pachyrhizi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18 hình thành tính kháng cao với các biến chủng nấm khác nhau ở nhiều vùng trên thế giới.
Ít có thông tin về sự tương tác phân tử giữa cây đậu tương và P. pachyrhizi cũng như con đường bảo vệ kích hoạt sự kháng lại tác nhân gây bệnh. Hiểu được cơ chế phân tử liên quan đến phản ứng kháng là một yếu tố quan trọng hàng đầu để kiểm soát khả năng chống chịu và tăng thích ứng trong điều kiện bị xâm nhiễm. Sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự gen, công cụ phân tích số liệu trên quy mô lớn, kết hợp với tin sinh học để phân tích dữ liệu để tạo ra một cơ sở dữ liệu có giá trị cho kỹ thuật di truyền. Với một lượng ít nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt đậu tương Châu Á, sử dụng công cụ di truyền trên để kiểm tra khả năng kháng của P. pachyrhizi trong miễn dịch (R: resistance) hệ gen. Vì vậy nghiên cứu kháng bệnh gỉ sắt đã tập trung vào kiểu gen độc lập như phân tích microarray để xác định các gen liên quan đến sức kháng và khả năng chống chịu.
Gen Rpp1 được xác định ở nhóm liên kết G và rất gần với chỉ thị Sct_187 (Hyten et al. 2006), gen Rpp2 nằm ở nhóm liên kết J và có 2 chỉ thị liên kết chặt là Satt_225 và Satt_620 (Abdedelnoor et al. 2007), Rpp3 nằm ở nhóm liên kết C2 và chỉ thị Satt_460 có liên kết chặt với gen này. Gen Rpp4 nằm ở nhóm liên kết G và liên kết chặt với chỉ thị Satt_288, Satt_191, gen Rpp3 cách Rpp1 một khoảng là 30 cM (Abdelnoor et al. 2007). Kết quả nghiên cứu các chỉ thị liên kết chặt với gen kháng là cơ sở vững chắc cho nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương kháng gỉ sắt.
Bước đầu nghiên cứu đã xác định được 4 gen kháng chi phối. Giống đậu tương PI 200492 được mô tả như có một dòng mang gen trội kháng bệnh gỉ sắt (Mc Lean và Byth 1980). Các locus sau này được đặt tên là Rpp1, hình thành phản ứng miễn dịch (không tổn thương) khi tiêm nhiễm nguồn bệnh nấm gỉ sắt. Nấm P.pachyrhizi bị cô lập bao gồm cả chủng nấm gỉ sắt Ấn Độ 73-1 (Hartwig và Bromfi et al. 1983).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19 Ba gen kháng Rpp2, Rpp3, Rpp4 tạo một phản ứng kháng khi tiêm nhiễm với các chủng P.pachyrhizi phân lập. Phản ứng kháng được đặc trưng bởi tổn thương màu nâu đỏ ít hoặc không có bào tử (Hartwig và Bromfi et al. 1983). Trong khi đó phản ứng kiểu hình dễ nhiễm bệnh do P.pachyrhizi được đặc trưng bởi tổn thương TAN với tốc độ gia tăng hình thành bào tử. Các gen kháng đã được chứng minh là cô lập của các chủng P.pachyrhizi trong phạm vi nước Mỹ. Mặc dù nghiên cứu trên chủng P.pachyrhizi là khó có thể tạo tính kháng trên một gen kháng duy nhất trong cây trồng. Do vậy, người ta có thể tích hợp các gen kháng vào cây trồng thương mại để tạo ra sức đề kháng phổ rộng. Hiện nay tất cả các nghiên cứu tại Hoa Kỳ và các phân lập nước ngoài của P.pachyrhizi xác định các gen kháng SBR phải thực hiện dưới sự kiểm soát An toàn sinh học mức độ 3. Marker phân tửđã được áp dụng thành công trong các loại cây trồng để xác định vị trí của gen kháng bệnh và locus lựa chọn trợ giúp của marker (Orf et al., 2004). Đơn giải trình tự lặp lại (SSR) đánh dấu, một công cụ thường sử dụng trong việc lựa chọn trợ giúp của marker, thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm thường rất đa hình có thểđược khảo sát đễ dàng trên hệ thống điện gel. Đậu tương hiện đang có một SSR bản đồ có chứa 1019 đánh dấu SSR phân phối trên 20 nhóm liên kết (Song et al., 2004) . Những dấu hiện có thểđược sử dụng để xác định vị trí gen kháng SRB và giúp nhanh chóng tích hợp các gen kháng vào giống hiện tạo thông qua lựa chọn giúp của chỉ thị.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 Gen Rpp1 nằm trong nhóm LG G ( Hyten et al. 2007; Chakraborty et al. 2009). Rpp2 nằm nhóm LG J (Silva et al.; Garcia et al.(2007) Rpp3 nằm nhóm LGC2 (Hyten et al. 2009). Rpp4 nằm nhóm LGG (Jenelle Meyer, et al. 2009) Rpp5 nằm nhóm LG N (Garcia et al. 2008).
Hình. 1.2 Các nhóm liên kết với gen kháng bệnh gỉ sắt đậu tương
Nghiên cứu của Hyten et al. 2007 về tính độc lập giữa gen Rpp1 và chỉ thị Sct_187 là không ý nghĩa, các nghiên cứu đều chỉ ra rằng hai locus này liên kết rất chặt. Các bản đồ liên kết tạo ra với ba đánh dấu SSR chỉ ra rằng gen Rpp1 nằm giữa Sct_187 và Sat-064 tại một khoảng cách 0,4 cM. Mối liên
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21 kết chặt chẽ của các chỉ thị Sct_187 và Sat-064 với gen kháng Rpp1 giúp các nhà chọn tạo lựa chọn được marker hữu ích cho công tác tạo giống. Sct_187 và Sat-064 là gen đa hình, có hệ số đa dạng cao tương ứng là 0.46 và 0.84 (Cregan el al ., 1999). Tuy nhiên chỉ một vài chỉ thịưu việt, sự phát triển của chỉ thị SSR và đánh dấu đa hình đơn giúp nhà lai tạo để tích hợp các Rpp1 kháng alen vào giống cải tiến và thuận lợi cho việc lập bản đồ của gen.
Phản ứng kháng chi phối bởi gen Rpp2 được nghiên cứu rộng rãi bởi các phân tích microarray (Vande Mortel et al. , 2007). Van de Mortel et al. (2007) sử dụng Affymetrix Chip gen để nghiên cứu những thay đổi trong biểu hiện gen kháng và kiểu gen nhạy cảm khi lây nhiễm ASR. Phản ứng gen phân tích gồm hai giai đoạn khi lây nhiễm P. pachyrhizi . Sự khác biệt trong biểu hiện gen sau12 giờ lây chủng (hpi) và trở lại mức gần như cơ bản sau 24 hpi, trong cả hai kiểu gen kháng và nhạy cảm. Tại 72 hpi giai đoạn thứ hai của sự biểu hiện gen kháng được quan sát, khả năng chống chịu tốt hơn của gen kháng so với kiểu gen nhạy cảm. Biểu hiện đường hướng kháng được tăng lên sau 72 giờ lây nhiễm. Gen kháng biểu hiện rất mạnh mẽ, gen trong giai đoạn này kết hợp với sao chép, truyền tín hiệu và hình thành lên các phản ứng bảo vệ. Gen kháng điển hình chẳng hạn như NBS- LRRs (vùng gắn các nucleotide, đoạn lặp lại giàu lecine), hình thành các receptor và các protein thụ thể giống nhau. Kiểu hình kháng cũng được biểu hiện Rpp3, Rpp4, Rpp5 cũng như gen Rpp2 và chúng biểu hiện cơ chế hình thành tính kháng chi phối bởi các gen kháng bệnh trung gian như gene- to- gene đã được ghi nhận.
Các nghiên cứu trên thế giới đã đưa ra kết quả thống nhất về nguồn gen qui định tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương, theo đó có 5 nguồn gen chính qui định tính kháng : Rpp1 (Cheng and Chan, 1968; Hidayat và Somaatmadja, 1977; McLean và Byth, 1980; Hartwing và Bromfield, 1983); Rpp2 (Hadayat và Somaatmadja, 1977); Rpp3 (Singh và Thapliyal, 1977; Bromfield và Hartwing, 1980); Rpp4 (Hartwig, 1986) và Rpp5 (Garcia và CS,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22 2008). Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Jenelle D.F. Meyer và cộng sự (2009) chỉ ra rằng gen Rpp4 có trong dòng PI459025B và được xác lập bản đồ di truyền với khoảng cách 2 centimorgan với chỉ thị Satt288 nằm trên nhiễm sắc thể 18 (nhóm liên kết G). Sử dụng kỹ thuật SSR và phát triển chỉ thị này bằng kỹ thuật chromosome contig vào vi khuẩn đối với gen Rpp4 trong quần thể phân ly Wm82. Phân tích các sản phẩm thu được người ta nhận thấy rằng gen Rpp4(PI59025B) biểu hiện mạnh mẽ nhất đặc tính kháng bệnh gỉ sắt, trong khi biểu hiện của những kiểu gen khác gần như không phát hiện được. Các số liệu cung cấp cho thấy Rpp4(PI59025B) giống như là một gen trội đơn kháng bệnh gỉ sắt Châu Á. Giải mã trình tự gen kháng Rpp4 từ tổ hợp lai (PI59025B x Williams 82) cho thấy được quy định bởi một nhóm gồm ba gen. Vùng gen CC- NBC- LRR (xoắn cuộn, gắn các nucleotide, đoạn lặp lại giàu lecine) khoảng cách 2 cM trên nhiễm sắc thể số 18, vùng trình tự này giống với nhóm RGC2 – nhóm gen kháng (Meyer et al. 2009). Sử dụng vius gây cân gen (VIGS) đã chứng minh rằng sự bất hoạt gen Rpp4 làm giảm sức kháng của giống PI459025B (là giống mang gen kháng Rpp4). Nó xác định được một gen trong nhóm gen đó chịu trách nhiệm chính quyết định tính kháng của PI459025B. Như vậy đây bằng chứng rõ ràng sự hoạt động của gen Rpp4 là nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt. Hơn nữa, các hoạt động của gen Rpp4 trong nhóm gen tạo ra các axit amin nhỏ khác nhau đóng một vai trò như một chìa khóa trong tính kháng bệnh gỉ sắt (Meyer et al. 2009).
Khi bệnh phát hiện đầu tiên ở Brazil, tất cả các gen kháng đã được công bốđều tỏ ra có hiệu quả kháng lại nấm gỉ sắt. Tuy nhiên đến năm 2003, xuất hiện nòi P. pachyrhizi mới đã phá vỡ khả năng kháng bằng gen Rpp1 và Rpp3 trong khi Rpp2 và Rpp4, Rpp5 vẫn biểu hiện kháng tốt. Mặc dù tính kháng của Rpp2 và Rpp4 được cho là khá ổn định ở Brazil (Hartman và cộng sự, 2005.) , chỉ những dòng, giống thừa hưởng nhiều gen kháng bệnh gỉ sắt có khả năng kháng bền vững trong tự nhiên do loài nấm này rất thích nghi và
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 hình thành biến chủng mới. Do vậy, phương pháp chồng gen kháng (pyramiding) để tạo ra khả năng kháng bệnh bền và phổ rộng. Chồng gen kháng (pyramiding) bao gồm nhiều gen khác nhau cùng có biểu hiện cho một kiểu hình đã được công nhận như một phương pháp tạo tính kháng mềm dẻo với các chủng gỉ sắt hơn là sử dụng một gen kháng cho bệnh gỉ sắt trên cây đậu tương. Trong nghiên cứu người ta thường nhằm mục đích tăng cường khả năng kháng bệnh gỉ sắt vào các dòng đậu tương chọn tạo. Tuy nhiên việc quy tụ nhiều gen kháng vào một giống cây trồng sử dụng phương pháp chọn tạo truyền thống khó mà đạt được kết quả bởi vì chúng ta phải đánh giá một lượng mẫu đa dạng các kiểu biểu hiện với các biến chủng bệnh khác nhau.
Do vậy, sử dụng marker để đánh giá và chọn tạo là một phương pháp hữu ích nhất đánh giá nhóm gen kháng bệnh gỉ sắt đậu tương. Có rất nhiều phương pháp để đánh giá nhóm gen khi các gen kháng này có mặt khác nhau ở các cặp bố mẹ như đánh giá trên quần thể F2 và F3, tạo dòng đẳng gen (NILs) và dòng đơn bội kép (DH) (Servin et al , 2004), việc sử dụng từng loại quần thể phụ thuộc vào các nguồn vật liệu có sẵn, các cặp bố mẹ và giống có sẵn cho nghiên cứu. Trong đậu tương, người ta đã xây dựng một bản đồ phân tử trong đó bao gồm các phân tửđánh dấu như SSR, RFLP, AFLP và Isozyme (Song el al., 2004), giúp cho nhà chọn giống có nhiều lựu chọn marker phù hợp cho từng gen kháng cụ thểở giai đoạn quần thểđầu tiên. Hơn nữa, một số chỉ thị SSR liên kết chặt chẽ với nguồn của các gen kháng đã được lập bản đồ, sử dụng các chỉ thị marker hữu hiệu này có thể dễ dàng đánh giá qua các thế hệ trong các quần thể lai. Các nhà nghiên cứu đề nghị phương pháp chồng gen kháng như là một cách có thể tăng cường khả năng kháng cho hiệu quả đối với chủng bệnh gỉ sắt đối với đậu tương (Hartman et al, 2005; Yamabaka et al, 2010, Lemos et al., 2011) trong chọn tạo giống đậu tương kháng gỉ sắt.