Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu
Thí nghiêm 1: Đánh giá đặc điểm hình thái, năng suất và chất lượng của các dòng, giống đậu tương trên đồng ruộng.
2.2.2.1 Đánh giá các đặc điểm hình thái của các dòng, giống đậu tương.
Thí nghiệm đồng ruộng: đánh giá tập đoàn đậu tương được bố trí theo phương pháp tuần tự, không nhắc lại với diện tích ô là 10 m2/ 1 công thức. Đối chứng là ĐT2000.Thời gian thực hiện trong vụ xuân 2014.
Đánh giá tập đoàn theo hướng dẫn AVRDC( 1979). Dựa vào sự khác biệt về hình thái: Màu sắc ( hoa, quả, hạt…), khả năng chống chịu sâu bệnh, khả năng chống đổ… Đối với các tính trạng số lượng như chiều cao cây, yếu tố cấu thành năng suất và năng suất….Trên cơ sở đó phân nhóm các giống mẫu đậu tương trong tập đoàn.
Các chỉ tiêu theo dõi
* Đánh giá đặc điểm hình thái: Màu sắc lá,màu hoa, hình dạng hạt, rốn hạt…
2.2.2.2 Đánh giá các đặc điểm sinh trưởng và phát triển của các dòng, giống đậu tương.
*Thời gian thời gian sinh trưởng( ngày): Thời gian từ khi gieo đến khi thu hoạch (ngày)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
*Khả năng sinh trưởng và phát triển: Chiều cao cây(cm), chiều cao đóng quả (cm), số cành cấp 1, sốđốt/ thân chính…
2.2.2.3 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất
- Số quả/cây (quả): đếm tổng số quả trên 10 cây mẫu/dòng, giống. Tính trung bình 1 cây khi thu hoạch
- Số quả chắc/cây (quả): đếm tổng số quả chắc trên 10 cây mẫu/ dòng, giống. Tính trung bình 1 cây khi thu hoạch
- Số quả 1 hạt/cây (quả): đếm tổng số quả 1 hạt trên 10 cây mẫu/dòng, giống. Tính trung bình 1 cây khi thu hoạch
Tỷ lệ quả 1 hạt (%) = (Số quả 1 hạt/tổng số quả trên cây) x 100%
- Số quả 3 hạt/cây (quả): đếm tổng số quả 3 hạt trên 10 cây mẫu/ dòng, giống. Tính trung bình 1 cây khi thu hoạch
Tỷ lệ quả 3 hạt (%) = (Số quả 3 hạt/tổng số quả trên cây) x 100%
- Khối lượng 1000 hạt (g): Tiến hành cân 3 mẫu, mỗi mẫu 1000 hạt ở độ ẩm 12%, lấy mỗi chữ số sau 1 dấu phẩy. Tiến hành cân khi hạt khô sau thu hoạch
- Năng suất cá thể (g/cây) = Khối lượng hạt trung bình của 10 cây mẫu
2.2.2.4. Đánh giá khả năng chống chịu các sâu bệnh hại chính trên đồng ruộng
- Sâu cuốn lá (%): tiến hành trước thu hoạch, điều tra ít nhất 10 cây đại diện theo phương pháp 5 điểm chéo góc
Tỷ lệ lá bị hại (%) = Số lá bị cuốn x 100 (%) Tổng số lá điều tra
- Sâu đục quả (%): tiến hành trước thu hoạch, điều tra ít nhất 10 cây đại diện theo phương pháp 5 điểm chéo góc
Tỷ lệ quả bị hại (%) = Số quả bị hại x 100 (%) Tổng số quảđiều tra
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36 mọc 7 ngày). Điều tra toàn bộ các cây/ô
Tỷ lệ cây bị bệnh (%) = Số cây bị bệnh x 100 (%) Tổng số cây điều tra
- Bệnh sương mai: tiến hành trước khi thu hoạch, đánh giá theo thang điểm từ 1- 9. Tiến hành điều tra ít nhất 10 cây đại diện theo phương pháp 5 điểm chéo góc. Điểm 1: rất nhẹ (<1% diện tích lá bị hại) Điểm 3: nhẹ (1-5% diện tích lá bị hại) Điểm 5: trung bình (>5% - 25% diện tích lá bị hại) Điểm 7: nặng (>25% - 50% diện tích lá bị hại) Điểm 9: rất nặng (>50% diện tích lá bị hại) 2.2.2.5. Đánh giá chất lượng hạt
Phân tích 2 chỉ tiêu: Hàm lượng protein và hàm lượng lipit trong 100 g hạt đậu tương.Tiến hành phân tích khi hạt khô sau thu hoạch
* Phân tích hàm lượng protein: bằng phương pháp Kjeldale
* Phân tích hàm lượng lipit (dầu): bằng phương pháp chưng cất trên bộ Soxlet
Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo
2.2.2.6. Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương bằng lây nhiễm nhân tạo.
Số mẫu: 35 mẫu giống đậu tương.
- Chủng nấm P.pachyhizi Sydow do Viện bảo vệ Thực vật cung cấp. - Đối chứng dương: ĐT2000( Kháng chuẩn).
- Đối chứng âm: V74 ( Nhiễm chuẩn).
Phương pháp: lây nhiễm nhân tạo bệnh gỉ sắt đậu tương (Phakopsora pachyhizi Sydow) theo Nguyễn Thị Bình (2008).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37
Trồng và chăm sóc đậu tương :
- Các giống tham gia thí nghiệm được gieo ngày 20/3/ 2014 trong nhà lưới cách ly, bố trí 3 lần nhắc mỗi ô 1 m2. Trồng và chăm sóc đậu tương theo đúng kỹ thuật, đất thí nghiệm tơi xốp, nhặt sạch cỏ dại.
- Mật độ trồng: Cây cách cây 5 cm và hàng cách hàng 25 cm
Chuẩn bị nguồn bệnh
Nguồn bệnh gỉ sắt đã được phân lập, chủng nấm lây nhiễm là chủng nấm gây hại mạnh nhất trên cây đậu tương hiện nay. Để chủđộng nhiễm bệnh nhân tạo vào những thời điểm theo yêu cầu của công tác nghiên cứu, chủng nấm được lưu giữ trên cây của giống đậu tương V74 (vì nấm gỉ sắt đậu tương là kí sinh chuyên tính) tại một khu vực có đầy đủ điều kiện cho bệnh phát triển và cách ly với khu sản xuất. Lá bị nhiễm bệnh nặng sẽ được lấy để thu bào tử của bệnh gỉ sắt bằng cách rửa bào tử trực tiếp trên lá của cây duy trì bệnh với nước cất vô trùng, sau đó lọc qua vải để loại bỏ cặn, xác định mật độ bào tử bằng buồng đến dưới kính hiểm vi (buồng đếm Hồng cầu), sau đó điều chỉnh mật độ bằng cách pha loãng. Khi dung dịch có mật độ bào tửđạt 5 x104 bào tử/ ml thì đạt tiêu chuẩn cho đem lây nhiễm trong thời gian cùng ngày.
Nhiễm bệnh nhân tạo lên cây đậu tương (trong ô xây nhà lưới)
Khi cây non có một lá kép đã mở hoàn toàn thì tiến hành lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp phun lên bề mặt lá.
- Tiến hành nhiễm bệnh nhân tạo vào chiều muộn, nhiệt độ trung bình trong ngày 250C.
- Dung dịch có chứa bào tử được chuyển sang bình phun có kích thước hạt sương mù, phun đều lên hai bề mặt lá của các mẫu thí nghiệm. Phun dịch bào tử lên lá với liều lượng 0,5 ml/ 1 dm2 lá.
- Tạo độẩm bằng che phủ nilông từ 12 – 24 giờđầu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38 Đánh giá tính kháng bệnh của các dòng, giống được tiến hành sau khi nhiễm bệnh 14 ngày, đánh giá từ 3- 4 lần, mỗi lần cách nhau từ 7 ngày cho đến khi giống đối chứng đạt cấp bệnh cao nhất.
Quan sát và đánh giá bệnh theo 3 chỉ tiêu:
* Quầng vàng hình thành
- Quan sát kích thước của quầng vàng hình thành xung quanh vết bệnh.
* Phản ứng của giống đối với bệnh
- Kháng : Vết bệnh có màu nâu đỏ hoặc nâu đậm (RB) - Nhiễm : Vết bệnh có màu nâu vàng (TAN)
- Trung gian : Trên lá có cả 2 loại vết bệnh nâu đỏ và nâu vàng (MIX).
* Mức độ hình thành bào tử
Mức độ hình thành bào tửđối với phản ứng RB theo thang điểm sau: 0: Không có bào tử 1: Tỷ lệ Bào tử < 10%
2: Tỷ lệ Bào tử < 25% 3: Tỷ lệ Bào tử < 50% 4: Tỷ lệ Bào tử < 75% 5: Tỷ lệ Bào tử ≤ 100%
Tỷ lệ % bào tử được tính bằng tổng số vết bệnh có bào tử trên tổng số vết bệnh đếm được của một đơn vị diện tích lá.
Thí nghiệm 3 : Sử dụng chỉ thị phân tử SSR khảo sát nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt trên các mẫu giống đậu tương.
2.2.2.7. Sử dụng chỉ thị phân tử SSR khảo sát nguồn gen kháng bệnh gỉ sắt trên các mẫu giống đậu tương.
Số mẫu: Gồm 35 mẫu dòng, giống
- 10 chỉ thị SSR: Sct_187; Sat-064; Sat_255; Satt620; Satt460; Satt134; Satt263; Satt 288; Sat_275; Sat_ 280 (Bảng 2)
- Đối chứng dương: là giống chứa gen kháng PI200492(Rpp1); PI230970(Rpp2); PI462312(Rpp3); PI459025B(Rpp4); PI200487(Rpp5). - Đối chứng âm: V74( giống nhiễm chuẩn)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39
Phương pháp tách chiết DNA từ các mẫu lá đậu tương
Chiết tách DNA theo Quy trình chiết tách DNA (Zheng và Cs có cải tiến năm 1995)
Thành phần dung dịch chiết tách DNA Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ Nồng độ dung dịch làm việc Hỗn hợp 10ml dung dịch chiết tách Tris- HCl (pH=8) 1M 50mM 0,5ml EDTA (pH=8) 0,5M 0,25mM 0,5ml NaCl 5M 300mM 0,6ml H2O 7,4ml Thành phần dung dịch đệm TE Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ Nồng độ dung dịch làm việc 50ml dung dịch TE làm việc Tris- HCl (pH=8) 1M 10mM 0,5ml EDTA (pH=8) 0,5M 1mM 0,1ml H2O 49,4ml
Quy trình chiết tách DNA
Bước 1: Thu ngắt mẫu lá khỏe, sau khi cây có 3 lá thật cắt 2cm bỏ vào ống nghiệm có dung tích 1,5 ml đánh dấu tên giống rồi bỏ vào đá lạnh. Trong phòng thí nghiệm các cối chày sứ đã dược hấp khử trùng đặt trong đá lạnh. Các mẫu lá được cắt nhỏ 0,5 cm bỏ vào cối chày sứ.
Bước 2: Nhỏ 800µl dung dịch chiết xuất ADN vào cối rồi nghiền nhỏ mẩu lá cho đến khi dung dịch chiết xuất chuyển sang màu xanh đen, chứng tỏ tế bào lá đã vỡ và diệp lục được giải phóng ra. Dịch nghiền thu được cho vào ống effendoff 2ml.
Bước 3: Cho thêm 30 µl dung dịch SDS, mix đều rồi ủ trong bể Water boat 650C trong vòng 1 giờ.
Bước 4: Đổ thêm hỗn hợp Chloroform : Isolamylalchohol (24:1) với tỉ lệ 1:1. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC rồi hút 400 µl dung dịch nổi phía trên ống nghiệm mới đã được đánh dấu cùng giống.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40
Bước 5: Cho thêm 400 µl dung dịch Isopropanol với tỉ lệ 1:1. Mix đều rồi ủ trong tủ lạnh -20oC trong vòng giờ.
Bước 6: Ly tâm 3 phút với tốc độ 12000 vòng/phút. Đổ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần kết tủa dưới đáy ống nghiệm.
Bước 7: Rửa kết tủa bằng Ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm.
Bước 8: Hòa tan kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ -20oC.
Kiểm tra độ nguyên vẹn và tinh sạch của DNA thu được
- Độ nguyên vẹn: 1 µl DNA + 7 µl TE + 2 µl loadding dye 6X trộn lẫn rồi nhỏ vào các giếng trên bản gel agarose 1%, chạy điện di với U = 65V, 60 phút. Nhuộm bằng Ethidium bromide sau đó quan sát hình ảnh điện di và đánh giá.
- Độ tinh sạch DNA: Đo bằng máy Nanodrop 1000 nếu tỷ số OD260/OD280 trong phạm vi 1.8-2.0 thì mẫu DNA đó được coi là sạch.
Phản ứng PCR
Tối ưu hoá phản ứng PCR cho các chỉ thị liên kết với gen kháng bệnh gỉ sắt đậu tương.
- Thành phần tham gia phản ứng gồm: 1µl DNA temple (10ng/ µl), 0,2 µl Dream Tag Polimerase 5U, 2,5 µl PCR Buffer 10X, 0,5µl dNTPs 10mM, 0,5 µl primer 10mM/mỗi mồi, thêm nước cất khử ion để tổng thể tích một phản ứng là 25 µl.
- Chu kì nhiệt sử dụng : + Bước 1: 950C trong 5 phút + Bước 2: 950C trong 30 giây
+ Bước 3: 48- 580C trong 30 giây tuỳ theo từng chỉ thị phân tử + Bước 4: 720C trong 1 phút;
+ Bước 5: 720C trong trong 5 phút + Bước 6: giữở 40C,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41 Bảng 2.1. Các chỉ thị liên kết gen kháng bệnh gỉ sắt TT Gen kháng NST - Nhóm liên kết Chỉ thị liên kết Khoảng cách (cM) Motif Tác giả Trình tự 1 Rpp1 18- G Sct_187 2 (TC)10 Hyten et al. 2007 F’CATGCTCCCATTCTCT R’AACATTGGCTTTTTACTTAG
Sat-064 (AT)34 F’TAGCTTTATAATGAGTGTGATAGAT