C. Phương pháp tô
7.XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ TINH BỘT TRONG CÁC SẢN PHẨM NGŨ CỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP AMYLOGLUCOSIDASE AMYLASE
CỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP AMYLOGLUCOSIDASE- AMYLASE (996,11 )
(Áp dụng cho xác định tổng tinh bột trong sản phẩm ngũ cốc.)
Xem bảng 996,11 cho các kết quả của nghiên cứu liên phòng hỗ trợ việc chấp nhận phương pháp này.
Chú ý: Xem Phụ lục B, ghi chú an toàn. Glucose oxidase-peroxidase- aminoantipyrine hỗn hợp đệm, BCA, và acetate bộ đệm chứa natri azit. Tránh tiếp xúc với da và mắt. Trong trường hợp tiếp xúc, bề mặt tiếp xúc ngay lập tức tuôn ra với nhiều nước. Xử lý các chất phản ứng vào bồn với đồng hoặc hệ thống ống nước dẫn cần được theo sau ngay lập tức với số lượng lớn nước để ngăn chặn các mối nguy hiểm tiềm năng nổ. Dimethyl sulfoxide là một chất kích thích da và nên được sử dụng một cách thận trọng
Mẫu thử được ngậm nước và tinh bột được thủy phân để maltodextrins với -amylase chịu nhiệt ở 95-100 ° C. Nhiệt độ và độ pH được điều chỉnh và maltosaccharides được số lượng thủy phân thành glucose với
amyloglucosidase tinh khiết . Glucose được xác định với đường tinh khiết cao oxidase - peroxidase thuốc thử . Sản phẩm có chứa tinh bột cao amylose hoặc tinh bột kháng được trước điều trị bằng dimethyl sulfoxide ở 95 ° C trước khi điều trị với -amylase . Hàm lượng tinh bột được báo cáo trên "như là" cơ sở .
B. Thiết bị
(a) mài Triệu đô - ly tâm , cánh quạt với 12 răng và 0,5 mm sàng , hoặc thiết bị tương tự. Ngoài ra, nhà máy lốc xoáy có thể được sử dụng cho số lượng nhỏ.
(b) ống Bench centrifuge. -Holding 16 120 mm nghiệm thủy tinh , với đánh giá của ca 1000 g .
(c ) Nước bath. - Duy trì 50 ± 0,1 ° C.
(d) Đun sôi nước sôi bath. - H2O ở 95-100 ° C (ví dụ , nồi chiên đầy H2O) .
(e) Vortex máy trộn . (f) pH Meter .
(g) giờ Stopclock ( kỹ thuật số) . ( h) Kết dư Top- tải .
(i) Cân phân tích .
(j) Phòng thí nghiệm oven. - Với buộc đối lưu ; duy trì 103 ± 1 ° C ; được sử dụng để xác định trọng lượng khô của mẫu thử nghiệm.
(l) Pipets. - Cung cấp 100 và 200 lít ; với lời khuyên dùng một lần. Ngoài ra, động cơ hộp khử mùi cầm tay có thể được sử dụng.
(m) chuyển tích cực pipetter. - Với 5,0 mL lời khuyên chính xác cung cấp 100 và 200 lít ; 50 lời khuyên ml cung cấp 3,0 ml.
(n) Dispenser. -500 ml , để cung cấp 3,0 ml. Sử dụng cho hỗn hợp đệm oxidase - peroxidase - aminoantipyrine glucose.
(o) Kính kiểm tra tubes. -16 120 mm, 17 ml , cho ly tâm ca 1000 g ; và 18 150 mm .
(p) Ống Nghiệm racks. -48 diễn ra , giữ 16 120 và 18 150 ống mm. (q) Thermometer. - Đọc 103 ± 1 ° C.
(r) Lọc paper. - nhanh , không tàn .
C. Hoá chất
(a) 3 - ( N- morpholino ) axit propanesulfonic ( BCA ) buffer. - pH 7,0 . Chứa 50 mM BCA , 5 mM clorua canxi , và 0,02 % natri azit . Trong 1 L bình định mức hòa tan 11,55 g BCA trong 900 ml H2O và điều chỉnh pH đến 7.0 với 1M HCl ( ca 17 ml ) . Thêm 0,74 g CaCl2.2H2O và 0,2 g natri azit . Pha loãng khối lượng với H2O . Đệm là ổn định ở nhiệt độ phòng .
(b) chịu nhiệt -amylase solution. - 10 ml ; 3000 U / ml. Pha loãng 1 ml dung dịch -amylase ( trong 50% glycerol) đến 30 ml với BCA đệm , (a) . Giải pháp chịu nhiệt -amylase ổn định lên đến 3 năm khi đông lạnh. (Lưu ý: Một đơn vị [ U] hoạt động của -amylase là lượng enzyme cần thiết để phát hành 1 nốt ruồi p -nitrophenol từ " kết thúc bị chặn " p -nitro maltoheptaoside trong sự hiện diện của bão hòa mức độ -glucosidase và amyloglucosidase [ tức là , Ceralpha -amylase khảo nghiệm thuốc thử ] ở 40 ° C và độ pH 6.0. ) giải pháp chịu nhiệt -amylase nên được miễn phí của các cấp phát hiện glucose miễn phí
Bảng 996,11 : kết quả nghiên cứu liên phòng để xác định tổng số tinh bột trong sản phẩm ngũ cốc chế biến bằng phương pháp amyloglucosidase - amylase
(c) Amyloglucosidase solution. - 10 ml ; 200 U / ml. Sử dụng trực tiếp mà không cần pha loãng. Giải pháp là nhớt ; cho pha chế , sử dụng tích cực chuyển quả . Amyloglucosidase giải pháp ổn định lên đến 3 năm ở 4 ° C. (Lưu ý: Một đơn vị [ U] của hoạt động của enzyme là lượng enzyme cần thiết để phát hành 1 nốt ruồi p -nitrophenol từ p -nitro - maltoside trong sự hiện diện của bão hòa mức độ -glucosidase [ tức là , khảo nghiệm thuốc thử
amyloglucosidase ] ở 40 ° C và pH 4,5 . ) giải pháp Amyloglucosidase nên được miễn phí của các cấp phát hiện glucose miễn phí.
(d) Glucose oxidase - peroxidase - aminoantipyrine đệm mixture. - Hỗn hợp glucose oxidase , 12000 U / L ; peroxidase , 650 U / L ; và 4
aminoantipyrine , 0.4 mM .
Chuẩn bị tập trung đệm bằng cách hòa tan 13,6 g KH2PO4 , 4,2 g NaOH , và 3,0 g acid 4 - hydroxybenzoic trong 90 ml H2O cất. Điều chỉnh pH 7,4 với một trong hai 2M HCl (16,7 ml HCl/100 mL) hoặc 2M NaOH (8,0 g
NaOH/100 mL) . Pha loãng dung dịch đến 100 ml , thêm 0,4 g natri azit , và trộn cho đến khi hòa tan . Đệm tập trung ổn định lên đến 3 năm ở 4 ° C.
Để chuẩn bị hỗn hợp đệm glucose oxidase - peroxidase -
aminoantipyrine , pha loãng 50 ml đệm tập trung đến 1,0 L. sử dụng một phần của bộ đệm pha loãng để hòa tan toàn bộ nội dung của lọ có chứa hỗn hợp oxidase - peroxidase đường đông khô . Chuyển nội dung lọ 1 lít bình định mức có chứa đệm pha loãng. Thuốc thử là 2-3 tháng ổn định ở 4 ° C và 2-3 năm ở nhiệt độ -20 ° C. Màu sắc hình thành với đường ổn định trong vài giờ. (Lưu ý: Glucose oxidase phải không bị nhiễm - và / hoặc -glucosidase và màu sắc nhiễm sắc phức tạp phải được ổn định ít nhất là 60 phút . )
Kiểm tra hình màu sắc và ổn định của hỗn hợp đệm glucose oxidase - peroxidase - aminoantipyrine bằng cách ủ ( bản) hỗn hợp đệm 3,0 ml glucose oxidase - peroxidase - aminoantipyrine với tiêu chuẩn đường ( 100 g khô glucose tinh thể trong 0,2 ml 0,2% dung dịch natri benzoate ) . Sau 15 , 20, 30 , và 60 phút ủ , đọc hấp thụ , A, dung dịch ở 510 nm . Hình thành màu tối đa sẽ đạt được trong vòng 20 phút , và màu sắc phải được ổn định ít nhất là 60 phút ở 50 ° C.
(e) Dung dịch nước ethanol. - Khoảng 80% ( v / v) . Pha loãng 80 ml ethanol 95% (phòng thí nghiệm cấp ) đến 95 ml với H2O .
(f) Sodium acetate đệm - . (1) 200 mM , pH 4.5. - Pipet 11,8 ml acid acetic băng ( 1,05 g / ml ) tới 900 mL H2O . Điều chỉnh pH đến 4,5 bằng dung dịch NaOH 1M ( ca 60 mL được yêu cầu) . Thêm 0,2 g natri azit và pha loãng thành 1 lít với H2O . (Chú ý: . . Sodium azide không nên được bổ sung cho đến khi pH được điều chỉnh axit hóa của phiên bản azide natri axit hydrazoic độc ) đệm là ổn định 12 tháng ở nhiệt độ phòng . (2) 50 mM , pH 4.5. - Pha loãng 200 mM đệm acetate 1 + 3 với H2O .
(g) Dimethyl sulfoxide (DMSO ) . - Phòng thí nghiệm lớp.
(h) Glucose tiêu chuẩn chứng khoán solution. -1 mg / ml. Trước khi chuẩn bị giải pháp , đường khô bột tinh thể (độ tinh khiết 97%) 16 giờ ở 60 ° C trong chân không. Hòa tan 0,1 g khô glucose, nặng đến mg , trong 100 mL nước cất.
(i) ngô starch. - Chứa nội dung được biết đến của tinh bột (ví dụ , ca 98% trọng lượng khô ) .
Mục ( a) - ( c) , (h) , và (i) được cung cấp trong Tổng tinh bột Khảo nghiệm kit có sẵn từ Megazyme quốc tế Ireland Ltd , Bray Business Park , Bray , Co Wicklow , Ireland.