C. Phương pháp tô
6.XÁC ĐỊNH TINH BỘT TRONG NGŨ CỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP GLUCOAMYLASE 979,
GLUCOAMYLASE 979,10
A. Hoá chất
(a) Glucoamylase solution. - 10 mg ( 30 IU) / mL H2O . Độ tinh khiết của enzyme là rất quan trọng ; cần được chuẩn bị từ Rhizopus delemar . Chuẩn bị Sumizyme 3000 từ Shin Nihon Chemical Co, 19-10 Showa -cho, Anjyo thành phố , Aichi, Nhật Bản , đã được tìm thấy thỏa đáng.
(b) D- Glucose tiêu chuẩn solution. -400 mg khan / L. Để yên 4 giờ để hoàn thành mutarotation trước khi sử dụng .
(c) Acetate buffer. -4M , pH 4,8 . Pha loãng 120 ml CH3COOH băng và 164 g CH3COONa khan trong 1 lít với H2O .
(d) Tris -phosphate buffer. - pH 7,0 . Hòa tan 36,3 g
trihydroxymethylaminomethane và 50,0 g NaH2PO4 • H2O (hoặc 45,5 g khan ) trong 500 mL H2O . Điều chỉnh pH đến 7.0 với H3PO4 ở 37 ° C và pha loãng thành 1 lít với H2O ở 37 ° C.
(e) Enzyme - đệm - nhiễm sắc mixture. Hòa tan trong 100 ml tris - đệm phosphate : 30 mg glucose oxidase ( loại II từ Aspergillus niger , Sigma Chemical Co ) , 3 mg peroxidase ( loại I từ cải ngựa, Sigma Chemical Co , số P 8125 ) , và 10 mg o- dianisidine • 2HCl . Phân tán o- dianisidine hoàn toàn trong số lượng nhỏ của bộ đệm trước khi thêm nó vào enzyme - đệm hỗn hợp . Lưu trữ 10 ngày ở 4 ° C. Có sẵn ở dạng chuẩn bị từ Sigma Chemical Co
B. Xác định
( Đối với sản phẩm có chứa D- glucose và polysaccharides có nguồn gốc từ tinh bột với dextrose tương đương < 14 , giải nén với 2 phần sôi 80 % cồn và 2 phần 80% rượu ở 25 ° C. Hủy bỏ rượu hoàn toàn bằng cách bốc hơi , vì rượu ức chế hoạt động glucoamylase . )
Mẫu thử xay đến < 0,5 mm ( số 40 sàng ) . Xác định độ ẩm. Nặng phần thử nghiệm 0,5 g ( 1,0 g chứa 0,5 g tinh bột ) vào sấy khô, cân nặng nón . Thêm 25 mL H2O khuấy đều và điều chỉnh độ pH 5-7 , nếu cần thiết. Đun nhẹ nhàng khuấy 3 phút và sau đó nồi hấp trong 1 giờ ở 135 ° C. ( Áp lực nồi hấp thấp hơn và nhiệt độ nhưng 1 giờ có thể được sử dụng với một số loại tinh bột hồ hóa để đạt được đầy đủ. ) Di chuyển từ nồi hấp , mát mẻ để ca 55 ° C , và thêm 2,5 ml dung dịch đệm acetate và đủ H2O để tổng trọng lượng của giải pháp của 45 ± 1 g . Đắm bình trong H2O tắm với shaker ở nhiệt độ tối ưu của glucoamylase sử dụng (thường là 55 ± 1 ° C) và thêm 5 giải pháp
glucoamylase ml. Thủy phân 2 giờ với rung liên tục, lọc qua gấp giấy vào 250 mL bình định mức , rửa số lượng , và pha loãng thành khối lượng .
Chuyển 1 mL chứa 20-60 g D-glucose để kiểm tra ống. Pha loãng dịch lọc, nếu cần thiết, để có được sự tập trung này. Thêm hỗn hợp đệm nhiễm sắc enzyme-2 ml, lắc ống, và diễn ra trong tối 37 ± 1 ° C đúng 30 phút để phát triển màu sắc. Ngăn chặn phản ứng bằng cách thêm 2 ml H2SO4 (1 + 1) và biện pháp A ở 540 nm.
Chuẩn bị đường chuẩn từ 0-60 g D-glucose/mL và trống. Bao gồm mẫu đối chứng có chứa tinh bột có độ tinh khiết được biết đến từ nguồn tương tự như vật liệu được kiểm tra.
tinh bột phần trăm= 0.9 (M/106) (V1/1) (250/V0) (100/E) (100/MS) = 2.25 (M V1/V0 E MS)
nơi mẫu E = g kiểm tra, M = g D-glucose từ đường cong chuẩn, V0 = mL từ 250 ml khối lượng, chất rắn MS = phần trăm trong mẫu kiểm tra, và V1 = thức mL nếu 250 mL được pha loãng thêm (V1 = 1 nếu không pha loãng).