L ỜI CẢM ƠN
3.ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu
+ Đàn lợn nái ngoại (Landrace,Yorkshire,Duroc),đang trong giai đoạn sinh sản nuôi tại các trang trại thuộc huyện Thuận Thành tỉnh Bắc Ninh.
+ Đàn lợn con được sinh ra từ những lợn mẹ mắc hội chứng M.M.A đang ở trong giai đoạn bú sữa.
3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu. 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu
Bốn trại chăn nuôi lợn nái sinh sản của huyện Thuận Thành tỉnh Bắc Ninh(Trại Đức Cự,Văn Doanh,Hồng Thái,Khắc Đương).
3.2.2 Thời gian nghiên cứu
Tháng 8/ 2011 - 8/ 2012
3.3 Nội dung nghiên cứu
3.3.1 Khảo sát tỷ lệ mắc hội chứng M.M.A ở đàn lợn nái nuôi theo mô hình trang trại tại huyện Thuận Thành tỉnh Bắc Ninh. trang trại tại huyện Thuận Thành tỉnh Bắc Ninh.
3.3.2 Ảnh hưởng của hội chứng M.M.A đến khả năng sinh sản của lợn nái. 3.3.3 Mối quan hệ giữa hội chứng M.M.A ở lợn mẹ và hội chứng tiêu chảy ở 3.3.3 Mối quan hệ giữa hội chứng M.M.A ở lợn mẹ và hội chứng tiêu chảy ở
lợn con.
3.3.4 Xác định sự thay đổi một số chỉ tiêu lâm sàng của lợn nái mắc hội chứng M.M.A (nhiệt độ, hô hấp, màu sắc dịch viêm …) chứng M.M.A (nhiệt độ, hô hấp, màu sắc dịch viêm …)
3.3.5 Sự biến đổi về vi khuẩn trong dịch viêm tử cung lợn nái bệnh.
+ Xác định thành phần các loại vi khuẩn trong dịch đường sinh dục ở lợn nái sinh sản bình thường và lợn nái bị hội chứng M.M.A.
+ Làm kháng sinh đồ xác định tính mẫn cảm với các loại vi khuẩn có trong dịch viêm tử cung của lợn nái bị hội chứng M.M.A.
3.3.6 Thử nghiệm điều trị hội chứng M.M.A ở lợn nái bằng các phác đồ khác nhau và theo dõi khả năng sinh sản sau khi khỏi bệnh. nhau và theo dõi khả năng sinh sản sau khi khỏi bệnh.
3.3.7 Đề xuất giải pháp kỹ thuật phòng hội chứng M.M.A.
3.4 Nguyên liệu nghiên cứu
3.4.1 Các môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
* Các môi trường phổ thông
- Môi trường nước thịt: dùng để nuôi cấy mẫu xét nghiệm ngay từ đầu. - Môi trường thạch thường: dùng để kiểm tra khuẩn lạc và làm kháng sinh đồ.
* Các môi trường chuyên dụng dùng trong phân lập và giám định vi khuẩn
- Môi trường Sapman: dùng để phân lập và xác định độc lực của cầu khuẩn. - Môi trường Brilliant Green agar: dùng để phân lập vi khuẩn E. Coli và
Salmonella.
- Môi trường Edwards medium: dùng để phân lập vi khuẩn Streptococcus. - Môi trường thạch máu: dùng để giữ và bảo quản vi khuẩn.
* Giấy tẩm kháng sinh
- Các mảnh giấy chuẩn đã được tẩm kháng sinh theo đúng tiêu chuẩn Quốc tế do hãng Oxoid (Anh) sản xuất.
- Các thuốc kháng sinh dùng để tẩm đều đạt tiêu chuẩn dược điển Việt Nam 1994 do phòng quản lý thuốc thú y - Cục thú y Trung ương cung cấp.
3.4.2 Phương pháp nghiên cứu
+ Xác định tỷ lệ lợn nái mắc hội chứng viêm tử cung, viêm vú và mất sữa bằng phương pháp điều tra, phỏng vấn trực tiếp công nhân làm tại các trại, kết hợp với theo dõi trực tiếp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Phân lập giám định thành phần, số lượng vi khuẩn trên các môi trường chuyên dụng theo các phương pháp vi sinh vật thường quy.
+ Thực hiện kỹ thuật kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby - Bauer. Kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt thạch xung quanh và ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn bịức chế thể hiện tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với thuốc kháng sinh. Trường hợp
không có vòng ức chế có nghĩa là vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh. Các vi khuẩn được xác định nuôi cấy là: Staphylococcus, Streptococcus, E. Coli và Salmonella.
+ Xác định phác đồđiều trị bệnh hữu hiệu qua theo dõi khả năng sinh sản của những lợn nái sau khi được điều trị lành bệnh.
3.4.3 Lấy mẫu dịch tử cung của lợn nái
* Cách lấy mẫu dịch tử cung lợn để xét nghiệm
Thực hiện lấy mẫu dịch tử cung của lợn nái bình thường sau đẻ 12 -24 giờ và lợn nái bị viêm tử cung ở các trại được điều tra.
Dùng mỏ vịt (đã được sát trùng) để mở âm đạo, sau đó lấy thìa sản khoa thu dịch tử cung cho vào ống nghiệm (đã được vô trùng), mỗi lần lấy khoảng 3- 5 ml.
* Bảo quản và xử lý mẫu
Các mẫu dịch thí nghiệm sau khi lấy đựơc bảo quản lạnh bằng thùng đá trong quá trình vận chuyển và bảo quản ở -200C tại phòng thí nghiệm cho đến khi phân tích.
3.4.4 Phương pháp xác định số loại và số lượng vi khuẩn
* Phương pháp xác định số loại vi khuẩn
Mỗi loại vi khuẩn khi mọc trên các môi trường thì khuẩn lạc có đặc tính mọc đặc trưng. Dựa vào những đặc điểm đặc trưng đó để xác định loại vi khuẩn có trong mẫu dịch tử cung.
- Môi trường thạch thường:
+ Staphylococcus: khuẩn lạc dạng S, tròn bóng, rìa gọn, mặt lồi, có màu vàng.
+ Streptococcus: khuẩn lạc dạng S, nhỏ, màu hơi xám, bóng.
+ Salmonella: khuẩn lạc dạng S, có thể dạng R, tròn, trong hoặc hơi xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa.
+E. Coli: khuẩn lạc dạng S, có thể dạng R, tròn, ướt, màu tro hay trắng nhạt, hơi lồi.
- Môi trường thạch MacConkey:
+ E. Coli: hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu hồng cánh sen. + Salmonella: khuẩn lạc tròn, trong không màu, nhẵn bóng, hơi lồi ở giữa.
- Môi trường thạch Birrilliant Green Agar:
+ E. Coli: khuẩn lạc dạng S, màu vàng chanh. + Salmonella: khuẩn lạc dạng S, màu hồng nhạt.
- Môi trường Chapman:
+ Staphylococcus: khuẩn lạc to, rìa gọn, nếu là tụ cầu gây bệnh làm môi trường biến màu vàng, nếu là tụ cầu không gây bệnh: môi trường màu đỏ.
- Môi trường Edwards Medium:
+ Streptococcus: vi khuẩn mọc tốt, khuẩn lạc nhỏ, mịn, ướt, mặt hơi lồi, trong sáng.
Trên cơ sở đó sau khi nuôi cấy mẫu trên môi trường thạch thường trong tủ ấm 37oC/18- 24 giờ, quan sát hình thái và kích thước khuẩn lạc ta có thể phân loại và xác định được số lượng của từng loại. Sau đó tiến hành phân lập, giám định các khuẩn lạc đó bằng cách chọn các khuẩn lạc điển hình cho từng loại vi khuẩn cấy sang các môi trường chuyên dụng.
* Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn
- Chúng tôi sử dụng phương pháp Koch: để có thể đếm được số khuẩn lạc trên môi trường thạch thường, tuỳ theo số vi khuẩn có trong bệnh phẩm. Mẫu xét nghiệm cần phải pha loãng đến mức độ cần thiết. Sau nhiều lần cấy mẫu với các độ pha loãng khác nhau, chúng tôi đã xác định đựơc độ pha loãng thích hợp với các bệnh phẩm như sau:
+ Dịch tử cung lợn sau đẻ là: 10-4. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Dịch tử cung lợn bị viêm tử cung là: 10-7.
- Sau khi pha loãng, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn vào đĩa thạch. Cấy dịch pha loãng mẫu trong môi trường thạch cứng rồi đếm số lượng khuẩn lạc (CFU). Số lượng CFU tương đương với số lượng vi khuẩn. Để có kết quả chính xác, cần thống nhất nhiệt độ và thời gian nuôi cấy. Số vi khuẩn có trong 1 ml dịch mẫu được tính theo công thức:
X = 10.A/N
Trong đó: X: số khuẩn lạc trong 1ml dịch.
A: số khuẩn lạc trung bình trên một đĩa petri. N: độ pha loãng.
3.4.5 Xác định độ mẫn cảm của các chủng vi khuẩn và tập đoàn vi khuẩn phân lập được từ dịch tử cung lợn với thuốc kháng sinh. khuẩn phân lập được từ dịch tử cung lợn với thuốc kháng sinh.
- Dùng tampon vô khuẩn nhúng vào nhuyễn dịch rồi lấy lên ép nhẹ và xoay nhẹ que gòn trên thành ống nghiệm. Động tác này sẽ loại bỏ được lượng huyễn dịch vi khuẩn thừa khỏi que gòn.
- Ria vi khuẩn lên mặt thạch. Chờ thạch khô trong vòng 3 - 5 phút. - Dùng panh vô trùng đặt các mảnh giấy kháng sinh tiếp xúc đều với mặt thạch. Các mảnh giấy tẩm kháng sinh đặt cách nhau không dưới 24 mm. Sau khi đặt các mảnh giấy vào đĩa thạch được khoảng 15 phút, đặt đĩa thạch vào tủ ấm 37oC, sau 16 - 18 giờ lấy ra đọc kết quả.
- Sau khi ủ 16 - 18 giờ, vi khuẩn sẽ mọc thành những khóm mịn tiếp hợp nhau và vòng vô khuẩn là một vòng tròn đồng nhất.
- Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước có đơn vị là mm, bằng cách áp thước lên mặt sau của đáy hộp thạch. Nếu cạnh của vòng ức chế không rõ nét thì phải đo chỗ hẹp nhất và chỗ rộng nhất rồi lấy giá trị trung bình. Đường kính của vòng vô khuẩn đựơc tính ra mm. Nếu khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập và thử lại.
3.5 Phương pháp thu nhận và xử lý số liệu
Tất cả các số liệu đều được theo dõi, ghi chép và xử lý bằng phương pháp thống kê sinh vật học thông qua phần mềm Excel trên máy vi tính.