6. Đóng góp mới của đề tài
3.2.2.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Chúng tôi tiến hành định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh bằng phương pháp Folin- Ciocalteau. Dịch chiết mẫu phản ứng với thuốc thử Folin - Ciacalteau tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu trên máy UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic để tính lượng polyphenol. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh Mẫu OD765nm Hàm lượng polyphenol (mg/l) Tỷ lệ polyphenol (%) Cao EtOH 0.437 424.2 4.242 Cao n-hexan 0.083 70.2 0.702 Cao CHCl3 0.261 248.2 2.482 Cao EtOAc 0.097 84.2 0.842 Cao nước 0.034 21.2 0.212
Từ kết quả bảng định lượng 3.4 cho thấy rằng, hàm lượng polyphenol tổng số trong cao phân đoạn nước là thấp nhất (0.212%). Ở phân đoạn cao cồn hàm lượng polyphenol tổng số chiếm tỉ lệ cao nhất (4.242%) sau đó đến
phân đoạn cao chloroform (2.482%). Trong khi đó phân đoạn n- hexan và EtOAc có hàm lượng polyphenol gần tương đương nhau (chiếm 0.702% và 0.842% tương ứng). Kết quả đó chỉ ra rằng, thành phần hóa học trong hạt đậu xanh có chứa nhiều hợp chất có khả năng tan tốt trong ethanol và chloroform.
Hàm lượng polyphenol tổng số chiếm tỷ lệ nhiều nhất trong cao phân đoạn ethanol. Đồng thời kết quả định lượng này cũng hoàn toàn phù hợp với mức độ các phản ứng định tính ở trên. Vì polyphenol là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao nên chúng tôi quyết định chọn các phân đoạn ethanol, ethylacetate, n- hexan, chloroform vào điều trị cho chuột béo phì và ĐTĐ.
3.2.3. Phân tích thành phần các chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh bằng sắc ký lớp mỏng
Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc kí bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck
Alufolien 60 F254 với nhiều hệ dung môi khác nhau. Qua thăm dò cho thấy hệ
dung môi (n- hexan : Acetone) = 5: 2 là cho kết quả rõ nét nhất và được chúng tôi lựa chọn. Kết quả thể hiện trên ảnh sắc ký đồ hình 3.3.
Hình 3.3. Ảnh chạy sắc ký đồ dịch chiết hạt đậu xanh
Ghi chú :
1. Cao phân đoạn nước
2. Cao phân đoạn n- hexan
3. Cao phân đoạn EtOAc
4. Cao phân đoạn EtOH
Nhìn trên ảnh sắc kí ta thấy xuất hiện rất nhiều các băng vạch khác nhau
về màu sắc và Rf. Về mặt lý thuyết thì mỗi băng vạch tương ứng với một chất
nhất định, nhưng trên thực tế có nhiều chất cùng Rf, thậm chí cùng màu sắc
nằm gối lên nhau nên mỗi vạch được coi là có ít nhất một chất trong nó. Vạch càng đậm thì các chất có nồng độ càng cao, vạch càng nhạt thì các chất có nồng độ càng nhỏ.
Bảng 3.5. Đặc điểm các băng vạch của các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh
ST T
Cao EtOH Cao n-
hexan Cao CHCl3 Cao EtOAc Cao nước Rf Màu Rf Màu Rf Màu Rf Màu Rf Màu
1 0.31 Vàng 0.29 Xanh nhạt 0.26 Nâu 0.34 Vàng 0.29 Xanh nhạt 2 0.34 Xanh nhạt 0.30 Vàng nhạt 0.34 Xanh 0.28 Nâu 0.39 Vàng nhạt 3 0.38 Nâu 0.34 Nâu 0.59 Vàng 0.40 Vàng nhạt 0.46 Nâu 4 0.46 Vàng 0.49 Nâu 0.64 Xanh nhạt 0.45 Nâu 5 0.51 Nâu đậm 0.51 Xanh đậm 0.67 Vàng 0.49 Xanh đậm 6 0.58 Xanh đậm 0.69 Xanh đậm 7 0.61 Vàng 0.71 Nâu 8 0.64 Nâu
Trên sắc kí đồ xuất hiện khá nhiều băng vạch màu vàng (đặc trưng của flavonoid), màu nâu (đặc trưng cho dầu béo), màu xanh chứng tỏ hạt đậu xanh chứa khá đầy đủ các polyphenol. Về mặt lý thuyết, mỗi băng vạch tương ứng với một chất nhất định song trên thực tế có nhiều băng vạch gối lên nhau.
băng vạch nhất, tiếp đến là phân đoạn CHCl3. Số vạch ở hai phân đoạn này dao động từ 7 đến 8 trong đó có nhiều băng trùng nhau hoặc gối lên nhau. Phân đoạn n- hexan, phân đoạn EtOAc và phân đoạn nước có khá ít băng vạch, số lượng băng vạch là 4 đến 5.
Từ kết quả này, chúng tôi quyết định chọn các phân đoạn ethanol, n- hexan, chloroform, ethylacetate vào điều trị cho chuột béo phì và ĐTĐ.
3.3. Kết quả thử độc tính theo đường uống
Xác định LD50 của dịch chiết cao cồn tổng số từ hạt đậu xanh trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke [27]. Chuột cho nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con và được cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết hạt đậu xanh thu được kết quả như bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả thử độc tính cấp theo đường uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Đến liều cao nhất 8000mg/kg thể trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chưa tính được LD50 theo đường uống. Mặt khác trong dân gian vẫn sử dụng hạt đậu xanh trong các bài thuốc và trong các món ăn hàng ngày. Điều này cũng cho thấy dịch chiết dưới dạng cao ethanol từ hạt đậu xanh được sử dụng theo đường uống không gây độc cho
chuột, vì vậy việc cho chuột uống các cao phân đoạn dịch chiết trong quá trình thí nghiệm là an toàn.
3.4. Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm và tác dụng của các cao phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh lên chuột béo phì
3.4.1. Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lượng ban đầu là
17 - 20g/con) được chia làm 12 lô.
Lô 1: cho ăn chế độ bình thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương).
Lô 2 - 12: cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol cao như bảng 2.2. Sau 6 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân trọng lượng chuột. Kết quả sự thay đổi trọng lượng chuột của lô nuôi thường và lô nuôi béo được thể hiện ở bảng 3.7 và hình 3.4.
Bảng 3.7. Trọng lượng trung bình của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dưỡng khác nhau
Nhóm
chuột Ban đầu
Trọng lượng trung bình của chuột tại các thời điểm khác nhau (g)
T uầ n 1 T uầ n 2 T uầ n 3 T uầ n 4 T uầ n 5 T uầ n 6 Nhóm ăn thường 18.34 20.17 23.08 26.35 29.87 32.01 35.52 ±1.07 ±0.38 ±0.57 ±0.62 ±1.01 ±1.12 ±1.07 Nhóm ăn béo 18.56 24.07 29.25 36.19 42.09 48.63 53.71 ±1.02 ±1.83 ±1.51 ±1.94 ±1.78 ±2.35 ±2.62
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau trong 6 tuần
Bảng 3.7 và hình 3.5 đã cho thấy rằng chuột được nuôi theo chế độ ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao có khả năng tăng về trọng lượng lớn hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thường và sự sai khác này là có ý nghĩa thống kê với trị số p < 0.05. Cụ thể là:
Tại thời điểm ban đầu sự khác nhau về trọng lượng không có ý nghĩa thống kê (p> 0.05).
Trong tuần đầu tiên, khi nuôi với chế độ thức ăn giàu lipid trọng lượng chuột đạt 24.07g và đã có ý nghĩa thống kê toán học.
Tại thời điểm 21 ngày, trọng lượng chuột nuôi béo đạt 36.19g tăng 37.34%; ở mức có ý nghĩa p<0.05 so với lô đối chứng (26.35g).
Đến ngày thứ 35 trọng lượng chuột nuôi béo đạt 48.63g tăng 51.92% với
p<0.05 so với lô chuột đối chứng nuôi thường (32.01g).
Kết thúc 42 ngày sau quá trình nuôi với chế độ thức ăn giàu chất béo, trọng lượng chuột nuôi béo nặng 53.71g, tăng 51.21% (p<0.05) so với lô đối chứng.
Đây là một kết quả khá khả quan, phù hợp với nhiều kết quả thực nghiệm trên chuột của các tác giả trong và ngoài nước. Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Liên và cộng sự, sau 6 tuần trọng lượng của chuột nuôi béo tăng gấp 1.55 lần tương ứng 55.01% với chuột ăn thường [12]. Srinivasan K. và cộng sự trên dòng chuột Cống Sprague- Dawley cũng cho thấy trọng lượng chuột sau 2 tuần ăn thức ăn có hàm lượng lipid cao đã tăng hơn so với chuột ăn thức ăn thường là 25.11g [32]. Những nghiên cứu về chuyển hóa các chất ở tế bào và mô cho chúng ta thấy rằng khi tiêu thụ chất béo vượt quá nhu cầu năng lượng của cơ thể thì chất béo sẽ được tích tụ ở mô mỡ gây béo phì. Như vậy, chế độ ăn giàu chất béo bão hòa là một trong những yếu tố nguy cơ gây lên bệnh béo phì cũng như các bệnh mãn tính liên quan.
Qua đó có thể khẳng định chuột nuôi bằng thức ăn giàu chất béo đã trở thành chuột béo phì về trọng lượng.
Tuy nhiên để có thêm cơ sở khẳng định chế độ dinh dưỡng giàu chất béo có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi lipid và carbohydrate ở chuột, chúng tôi tiến hành xét nghiệm một số chỉ số hóa sinh có liên quan tới rối loạn trao đổi lipid để xác định chuột có thực sự béo phì hay không và kết quả thu được như bảng 3.8.
Bảng 3.8. So sánh một số chỉ số lipid máu giữa chuột nuôi thường và nuôi béo phì thực nghiệm
Nhóm chuột Các chỉ số lipid (mmol/l)
TC TG HDL-c LDL-c Glucose Nhóm ăn thường 4.34 1.75 1.41 2.46 5.85 ±0.32 ±0.25 ±0.21 ±0.37 ±0.33 Nhóm ăn béo 5.86* 2.42* 0.83* 3.52* 8.71* ±0.41 ±0.30 ±0.27 ±0.34 ±0.31 % thay đổi ↑35.02 ↑38.3 ↓41.13 ↑43.08 ↑48.9 (*): p < 0.05
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột
Kết quả ở bảng 3.8 và hình 3.6 cho thấy các lô chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid cao đều có rối loạn một số chỉ số lipid máu so với các lô chuột ăn thức ăn bình thường. Cụ thể:
Hàm lượng LDL –c trong máu chuột ăn thức ăn béo là 3.52 mmol/l, tăng 43.08% so với nhóm nuôi thường (2.46 mmol/l) với p < 0.05. Trái lại, HDL –c lại có sụt giảm mạnh, giảm tới 41.13 % so với chuột nuôi thường (1.41mmol/l), với p< 0.05.
Hàm lượng cholesterol toàn phần, triglycerid trong huyết thanh của nhóm chuột nuôi béo tương ứng tăng 35.02%, 38.3% so với nhóm chuột nuôi bằng thức ăn thường.
Hàm lượng glucose của chuột trong nhóm ăn thức ăn béo là 8.71 mmol/l, tăng 48.9% so với chuột thường (5.85mmol/l).
Như vậy, khi cho chuột ăn thức ăn có hàm lượng chất béo cao dẫn đến không chỉ tăng về trọng lượng mà các chỉ số lipid như cholesterol tổng số, triglycerid, LDL-c cũng tăng một cách rõ rệt. Sự tăng cao nồng độ glucose huyết của chuột ăn thức ăn giàu chất béo đã chỉ ra rằng, ở nhóm chuột này đã có sự biểu hiện của hiện tượng kháng insulin. Đây là nguy cơ của chuột béo phì dẫn đến ĐTĐ type 2.
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với quy luật thực tế và nghiên cứu của Srinivasan và cộng sự là chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid cao trong thời gian dài rất dễ dẫn đến rối loạn trao đổi chất glucid- lipid [32].
Như vậy với các dẫn liệu trọng lượng cơ thể, các chỉ số mỡ máu tăng cao bất thường, đồng thời theo quan sát của chúng tôi chuột nuôi béo hoạt động chậm chạp hơn chuột nuôi thường. Chúng tôi có thể kết luận rằng mô hình gây chuột béo phì bằng chế độ thức ăn giàu chất béo đã thành công. Chuột béo phì được tiếp tục sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết hạt đậu xanh đến trọng lượng chuột béo phì thực nghiệm lượng chuột béo phì thực nghiệm
Từ kết quả tạo thành công mô hình chuột béo phì thực nghiệm chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng giảm khối lượng chuột béo phì của các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh. Thời gian điều trị là 3 tuần với liều lượng cho uống là 2000mg dịch chiết/kg thể trọng/ngày. Cao của các phân đoạn dịch chiết được hoà vào nước ấm và cho chuột uống hàng ngày vào mỗi buổi sáng.
Trong thời gian 21 ngày điều trị, chúng tôi tiến hành cân trọng lượng của chuột vào thời điểm ngày thứ 7, ngày thứ 14 và ngày thứ 21, thu được kết quả như ở bảng 3.9 và hình 3.7.
Bảng 3.9. Trọng lượng các lô chuột trước và sau 3 tuần điều trị Các lô chuột điều trị Trước điều trị Trọng lượng chuột (g)
Sau 7 ngày Sau 14 ngày Sau 21 ngày
1 Chuột ăn chuẩn 35.52±1.29 37.49±1.23 40.42±1.66 43.19±2.75 ↑5.5% ↑13.8% ↑21.6% 2 Chuột BP không điều trị 52.61±1.37 53.08±1.48 54.72±1.41 55.39±2.60 ↑0.9% ↑4.01% ↑5.3% 3 Chuột BP + Cao EtOH 52.36±1.22 47.91*±1.84 44.58*±2.13 38.11*±1.69 ↓8.9% ↓14.8% ↓27.2% 4 Chuột BP + Cao n-hexan 52.41±1.52 50.26*±1.22 46.08*±2.21 43.75*±1.88 ↓4.1% ↓12.08% ↓16.5% 5 Chuột BP + Cao CHCl3 53.17±1.37 48.39*±1.56 45.11*±1.49 40.02*±1.71 ↓8.9% ↓15.1% ↓24.7% 6 Chuột BP + Cao EtOAc 51.77±1.53 48.06*±1.91 45.27*±1.34 42.08*±2.35 ↓7.2% ↓12.6% ↓18.7% Ghi chú: (*): p < 0.05
Hình 3.7. Biểu đồ so sánh trọng lượng cơ thể chuột trước và sau 3 tuần điều trị
Qua bảng số liệu trên ta thấy, sau 21 ngày trọng lượng của các lô chuột có sự thay đổi đáng kể. Ở lô đối chứng cho uống nước bình thường trọng lượng của các lô chuột vẫn tiếp tục tăng .Tuy nhiên ở lô 1 (chuột ăn chuẩn) khả năng tăng trọng của chuột lớn hơn so với lô 2 (chuột béo phì không điều trị) tương ứng với 21.6% và 5.3%.
Ở các lô 3, 4, 5 và 6, chuột nuôi với chế độ thức ăn có hàm lượng lipid cao, nhưng được điều trị bằng cách cho chuột uống cao các phân đoạn dịch chiết của hạt đậu xanh, chúng tôi nhận thấy trọng lượng cơ thể sau 21 ngày
điều trị của các lô chuột đều giảm đáng kể.Trong đó, chuột được điều trị bằng
cao phân đoạn cồn giảm mạnh nhất (27.2%), ở cao phân đoạn n-hexan giảm
thấp nhất (16.5%), các phân đoạn CHCl3, EtOAc giảm tương ứng 24.7%,
18.7%.
Hiện nay trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về giảm trọng lượng của các dịch chiết từ nhiều loài thực vật khác nhau. Một số hợp chất cũng đã được phân lập từ những loài thực vật này và chứng minh là chúng có tác dụng giảm thể trọng. Theo nghiên cứu của Huang Y.M (2009) [25] về tác dụng
chống béo phì của dịch chiết vỏ Cam, Trà đen, Cà phê ...trên mô hình chuột. Những nghiên cứu này chỉ ra rằng: chuột ăn thức ăn giàu chất béo có chứa 0,2% dịch chiết vỏ Cam, Trà đen trong 10 tuần đã làm giảm 48,8% trọng lượng các lô chuột so với nhóm đối chứng (ăn thức ăn béo và uống nước). Nghiên cứu của Ono-Y. và cộng sự (2006) đã chỉ ra tác dụng chống béo phì
từ lá sen hồng (Nelumbo nucifera) đến các enzyme tiêu hoá, quá trình trao đổi
lipid và quá trình sản sinh năng lượng trên mô hình chuột cống và chuột nhắt trắng thực nghiệm [28].
Kết quả cho thấy các cao phân đoạn từ dịch chiết hạt đậu xanh có tác dụng giảm trọng lượng rất tốt ở chuột béo phì thực nghiệm, đặc biệt là cao phân đoạn EtOH làm giảm trọng lượng mạnh nhất.
3.5. Kết quả tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm và tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh đến chuột ĐTĐ type 2 các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh đến chuột ĐTĐ type 2
3.5.1. Kết quả tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm
Hiện nay, có rất nhiều mô hình gây ĐTĐ thực nghiệm trên thế giới, các mô hình khác nhau sẽ sử dụng các phương pháp khác nhau và điều này phụ thuộc vào loại ĐTĐ (type 1, type 2), các dòng chuột khác nhau. Đối với mô hình ĐTĐ type 1thông thường người ta tiêm STZ hoặc alloxan ở liều cao vào chuột mà không cần phải qua thời gian nuôi béo do tác dụng phá hủy hoàn toàn tế bào β của đảo tụy bởi STZ và alloxan. Đối với mô hình ĐTĐ type 2 lại tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố như dòng chuột, thời gian nuôi, chế độ ăn thức ăn