6. Đóng góp mới của đề tài
2.2.5. Phương pháp xử lý thống kê
Chỉ số glucose huyết được so sánh giữa thời điểm trước và sau nghiên cứu; so sánh giữa các lô dùng thuốc và lô đối chứng ở cùng thời điểm.
* Tỷ lệ tăng glucose huyết được tính theo công thức
Tỷ lệ % tăng glucose huyết:
X1 – Tỷ lệ % tăng glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá
Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t- test student với p< 0.05
có ý nghĩa thống kê.
* Tỷ lệ hạ glucose huyết, (TC, HDL-c, LDL-c, TG) được tính theo công thức dưới đây
Tỷ lệ % hạ glucose huyết:
X2 – Tỷ lệ % hạ glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá
Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t- test student với p< 0.05 có ý nghĩa thống kê.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ hạt đậu xanh
Để tìm hiểu thành phần hóa học của hạt đậu xanh và qua tham khảo các tài liệu chúng tôi lựa chọn quy trình tách chiết được mô tả như sau:
Phân lớp n- hexan Phân lớp nước
Cao PĐ n- hexan (33,28g) Phân lớp CHCl3 Phân lớp nước
Phân lớp EtOAc Phân lớp nước
Cao PĐ EtOAc
(15,26g) Cao PĐ nước (64,19g) Cao PĐ CHCl3
(21,07g)
Loại dung môi
Loại dung môi
Loại dung môi
Loại dung môi
Chiết phân đoạn 3 lần
với CHCl3 (1:1)
Chiết phân đoạn 3 lần với EtOAc (1:1)
Hình 3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ hạt đậu xanh
HẠT ĐẬU XANH ( 3000g) Cao cồn tổng số (186,71g) Để lại 20% (37,34g) cao cồn tổng số
Hòa tan trong nước, chiết phân đoạn 3 lần với n- hexan (1:1)
9
Ngâm kiệt 3 lần với EtOH, lọc thu dịch chiết, cô loại dung môi
Quy trình tách chiết các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ hạt đậu xanh được thực hiện như sau: Ngâm 3000g bột mịn hạt đậu xanh trong 10 lít cồn 96% trong vòng 2 tuần ở nhiệt độ phòng, sau đó cất lại dung môi. Tiếp tục cho cồn vào và cất lại 2 lần nữa, cô loại dung môi thu được 186.71g cao cồn tổng số. Chúng tôi để lại 20% (37.34g) cao cồn để làm các thí nghiệm tiếp theo. Phần còn lại hoà tan vào nước ấm, chiết 3 lần qua dung môi n-hexan theo tỷ lệ 1:1 về thể tích. Lấy phân lớp n-hexan đi cô loại dung môi được 33.28g cao phân đoạn n-hexan. Phân lớp nước còn lại hoà tan với chloroform theo tỷ lệ 1:1 về thể tích (lặp lại 2 lần nữa), thu phân lớp chloroform cô loại dung môi được 21.07g cao phân đoạn chloroform. Phân lớp nước tiếp tục đem hoà tan với ethylacetat (lặp lại 2 lần nữa), thu phân lớp ethylacetat cô loại dung môi được 15.26g cao phân đoạn ethylacetat. Cuối cùng cô cạn lớp nước còn lại thu được 64.19g cao phân đoạn nước.
Với quy trình chiết rút như trên, chúng tôi thu được hiệu suất chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ hạt đậu xanh như bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ hạt đậu xanh
Phân đoạn Mẫu ban đầu (g)
Hiệu suất chiết rút (%) Cao PĐ ethanol 186.71 6.22 Cao PĐ n – hexan 33.28 1.1 Cao PĐ chloroform 21.07 0.7 Cao PĐ ethylacetate 15.26 0.5 Cao PĐ nước 64.19 2.14
Căn cứ vào kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi nhận thấy rằng hiệu suất chiết rút cao nhất là ở phân đoạn cao ethanol (6.22%) so với khối lượng nguyên liệu khô ban đầu là 3000g, tiếp đến là cao phân đoạn nước (2.14%), cao phân đoạn n- hexan là (1.1%), cao phân đoạn chloroform (0.7%) và thấp nhất là ở cao phân đoạn ethylacetate (0.5%). Kết quả này cho thấy
trong hạt đậu xanh có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên. Khối lượng cao các phân đoạn thu được đủ để chúng tôi thực hiện các phản ứng định tính, định lượng và thí nghiệm trên mô hình chuột thực nghiệm.
3.2. Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết hạt đậu xanh đoạn dịch chiết hạt đậu xanh
3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên trong hạt đậu xanh
Chúng tôi tiến hành thử định tính các hợp chất tự nhiên bằng các phản ứng thử đặc trưng, kết quả định tính được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả thử định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết hạt đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczeck)
Nhóm chất Thuốc thử Mẫu Cao PĐ EtOH Cao PĐ n- hexan Cao PĐ CHCl3 Cao PĐ EtOAc Cao PĐ Nước Flavonoid Shinoda ++ + ++ ++ + Diazo ++ + + + - H2SO4 đặc +++ + ++ + - Catechin Vanilin/HCl(đ) ++ - + - - Tannin Vanilin + + + - + Gelatin/NaCl + + + + + Acetat chì + - - + - Polyphenol khác NaOH 10% ++ + + + + FeCl3 5% ++ + + - + Glycoside Keller-killian + + + + + Alkaloid Mayer + - - + - Dragendroff + + + - - Bouchardat + - + + -
(Ghi chú: (+): Các mức phản ứng dương tính (-): Phản ứng âm tính; Mức độ phản ứng được thể hiện bằng số dấu cộng)
Từ kết quả định tính cho thấy trong thành phần hạt đậu xanh có chứa các hợp chất tự nhiên khác nhau như flavonoid, alkaloid, glycoside và một số polyphenol khác. Flavonoid có phản ứng dương tính ở tất cả các phân đoạn, chứng tỏ trong hạt đậu xanh có chứa nhiều nhóm hợp chất này. Đặc biệt hai phân đoạn cao cồn và cao chloroform có chứa tương đối đầy đủ các nhóm hợp chất và có hàm lượng lớn hơn so với các phân đoạn khác do cho phản ứng mạnh với thuốc thử. Còn ở cao phân đoạn n- hexan, ethylacetate và cao phân đoạn nước cho thấy có mặt của nhiều nhóm chất như flavonoid, catechin, tannin nhưng với hàm lượng thấp vì nhiều phản ứng vẫn cho kết quả âm tính.
Như vậy hai phân đoạn cao cồn tổng số và phân đoạn chloroform chứa nhiều hợp chất polyphenol như flavonoid, tannin... là những chất có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư. Kết quả định tính này giúp chúng tôi có những định hướng để tiếp tục nghiên cứu trên mô hình động vật thực nghiệm.
3.2.2. Định lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết theo kỹ thuật Folin - Ciocalteau
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp Folin - Ciocalteau.
3.2.2.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
Đường chuẩn acid gallic được xây dựng bằng cách chuẩn bị dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500 mg/l, tiến hành trên máy UV VIS 1000 ở bước sóng 765nm. Kết quả thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2.
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
TT Acid gallic (mg/l) OD (765nm) 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265
6 500 0.519 Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn acid gallic
3.2.2.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số.
Chúng tôi tiến hành định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh bằng phương pháp Folin- Ciocalteau. Dịch chiết mẫu phản ứng với thuốc thử Folin - Ciacalteau tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu trên máy UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic để tính lượng polyphenol. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh Mẫu OD765nm Hàm lượng polyphenol (mg/l) Tỷ lệ polyphenol (%) Cao EtOH 0.437 424.2 4.242 Cao n-hexan 0.083 70.2 0.702 Cao CHCl3 0.261 248.2 2.482 Cao EtOAc 0.097 84.2 0.842 Cao nước 0.034 21.2 0.212
Từ kết quả bảng định lượng 3.4 cho thấy rằng, hàm lượng polyphenol tổng số trong cao phân đoạn nước là thấp nhất (0.212%). Ở phân đoạn cao cồn hàm lượng polyphenol tổng số chiếm tỉ lệ cao nhất (4.242%) sau đó đến
phân đoạn cao chloroform (2.482%). Trong khi đó phân đoạn n- hexan và EtOAc có hàm lượng polyphenol gần tương đương nhau (chiếm 0.702% và 0.842% tương ứng). Kết quả đó chỉ ra rằng, thành phần hóa học trong hạt đậu xanh có chứa nhiều hợp chất có khả năng tan tốt trong ethanol và chloroform.
Hàm lượng polyphenol tổng số chiếm tỷ lệ nhiều nhất trong cao phân đoạn ethanol. Đồng thời kết quả định lượng này cũng hoàn toàn phù hợp với mức độ các phản ứng định tính ở trên. Vì polyphenol là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao nên chúng tôi quyết định chọn các phân đoạn ethanol, ethylacetate, n- hexan, chloroform vào điều trị cho chuột béo phì và ĐTĐ.
3.2.3. Phân tích thành phần các chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh bằng sắc ký lớp mỏng
Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc kí bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck
Alufolien 60 F254 với nhiều hệ dung môi khác nhau. Qua thăm dò cho thấy hệ
dung môi (n- hexan : Acetone) = 5: 2 là cho kết quả rõ nét nhất và được chúng tôi lựa chọn. Kết quả thể hiện trên ảnh sắc ký đồ hình 3.3.
Hình 3.3. Ảnh chạy sắc ký đồ dịch chiết hạt đậu xanh
Ghi chú :
1. Cao phân đoạn nước
2. Cao phân đoạn n- hexan
3. Cao phân đoạn EtOAc
4. Cao phân đoạn EtOH
Nhìn trên ảnh sắc kí ta thấy xuất hiện rất nhiều các băng vạch khác nhau
về màu sắc và Rf. Về mặt lý thuyết thì mỗi băng vạch tương ứng với một chất
nhất định, nhưng trên thực tế có nhiều chất cùng Rf, thậm chí cùng màu sắc
nằm gối lên nhau nên mỗi vạch được coi là có ít nhất một chất trong nó. Vạch càng đậm thì các chất có nồng độ càng cao, vạch càng nhạt thì các chất có nồng độ càng nhỏ.
Bảng 3.5. Đặc điểm các băng vạch của các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh
ST T
Cao EtOH Cao n-
hexan Cao CHCl3 Cao EtOAc Cao nước Rf Màu Rf Màu Rf Màu Rf Màu Rf Màu
1 0.31 Vàng 0.29 Xanh nhạt 0.26 Nâu 0.34 Vàng 0.29 Xanh nhạt 2 0.34 Xanh nhạt 0.30 Vàng nhạt 0.34 Xanh 0.28 Nâu 0.39 Vàng nhạt 3 0.38 Nâu 0.34 Nâu 0.59 Vàng 0.40 Vàng nhạt 0.46 Nâu 4 0.46 Vàng 0.49 Nâu 0.64 Xanh nhạt 0.45 Nâu 5 0.51 Nâu đậm 0.51 Xanh đậm 0.67 Vàng 0.49 Xanh đậm 6 0.58 Xanh đậm 0.69 Xanh đậm 7 0.61 Vàng 0.71 Nâu 8 0.64 Nâu
Trên sắc kí đồ xuất hiện khá nhiều băng vạch màu vàng (đặc trưng của flavonoid), màu nâu (đặc trưng cho dầu béo), màu xanh chứng tỏ hạt đậu xanh chứa khá đầy đủ các polyphenol. Về mặt lý thuyết, mỗi băng vạch tương ứng với một chất nhất định song trên thực tế có nhiều băng vạch gối lên nhau.
băng vạch nhất, tiếp đến là phân đoạn CHCl3. Số vạch ở hai phân đoạn này dao động từ 7 đến 8 trong đó có nhiều băng trùng nhau hoặc gối lên nhau. Phân đoạn n- hexan, phân đoạn EtOAc và phân đoạn nước có khá ít băng vạch, số lượng băng vạch là 4 đến 5.
Từ kết quả này, chúng tôi quyết định chọn các phân đoạn ethanol, n- hexan, chloroform, ethylacetate vào điều trị cho chuột béo phì và ĐTĐ.
3.3. Kết quả thử độc tính theo đường uống
Xác định LD50 của dịch chiết cao cồn tổng số từ hạt đậu xanh trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke [27]. Chuột cho nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con và được cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết hạt đậu xanh thu được kết quả như bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả thử độc tính cấp theo đường uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Đến liều cao nhất 8000mg/kg thể trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chưa tính được LD50 theo đường uống. Mặt khác trong dân gian vẫn sử dụng hạt đậu xanh trong các bài thuốc và trong các món ăn hàng ngày. Điều này cũng cho thấy dịch chiết dưới dạng cao ethanol từ hạt đậu xanh được sử dụng theo đường uống không gây độc cho
chuột, vì vậy việc cho chuột uống các cao phân đoạn dịch chiết trong quá trình thí nghiệm là an toàn.
3.4. Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm và tác dụng của các cao phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh lên chuột béo phì
3.4.1. Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lượng ban đầu là
17 - 20g/con) được chia làm 12 lô.
Lô 1: cho ăn chế độ bình thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương).
Lô 2 - 12: cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol cao như bảng 2.2. Sau 6 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân trọng lượng chuột. Kết quả sự thay đổi trọng lượng chuột của lô nuôi thường và lô nuôi béo được thể hiện ở bảng 3.7 và hình 3.4.
Bảng 3.7. Trọng lượng trung bình của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dưỡng khác nhau
Nhóm
chuột Ban đầu
Trọng lượng trung bình của chuột tại các thời điểm khác nhau (g)
T uầ n 1 T uầ n 2 T uầ n 3 T uầ n 4 T uầ n 5 T uầ n 6 Nhóm ăn thường 18.34 20.17 23.08 26.35 29.87 32.01 35.52 ±1.07 ±0.38 ±0.57 ±0.62 ±1.01 ±1.12 ±1.07 Nhóm ăn béo 18.56 24.07 29.25 36.19 42.09 48.63 53.71 ±1.02 ±1.83 ±1.51 ±1.94 ±1.78 ±2.35 ±2.62
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau trong 6 tuần
Bảng 3.7 và hình 3.5 đã cho thấy rằng chuột được nuôi theo chế độ ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao có khả năng tăng về trọng lượng lớn hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thường và sự sai khác này là có ý nghĩa thống kê với trị số p < 0.05. Cụ thể là:
Tại thời điểm ban đầu sự khác nhau về trọng lượng không có ý nghĩa thống kê (p> 0.05).
Trong tuần đầu tiên, khi nuôi với chế độ thức ăn giàu lipid trọng lượng chuột đạt 24.07g và đã có ý nghĩa thống kê toán học.
Tại thời điểm 21 ngày, trọng lượng chuột nuôi béo đạt 36.19g tăng 37.34%; ở mức có ý nghĩa p<0.05 so với lô đối chứng (26.35g).
Đến ngày thứ 35 trọng lượng chuột nuôi béo đạt 48.63g tăng 51.92% với
p<0.05 so với lô chuột đối chứng nuôi thường (32.01g).
Kết thúc 42 ngày sau quá trình nuôi với chế độ thức ăn giàu chất béo, trọng lượng chuột nuôi béo nặng 53.71g, tăng 51.21% (p<0.05) so với lô đối chứng.
Đây là một kết quả khá khả quan, phù hợp với nhiều kết quả thực nghiệm trên chuột của các tác giả trong và ngoài nước. Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Liên và cộng sự, sau 6 tuần trọng lượng của chuột nuôi béo tăng gấp 1.55 lần tương ứng 55.01% với chuột ăn thường [12]. Srinivasan K. và cộng sự trên dòng chuột Cống Sprague- Dawley cũng cho thấy trọng lượng chuột sau 2 tuần ăn thức ăn có hàm lượng lipid cao đã tăng hơn so với chuột ăn thức ăn thường là 25.11g [32]. Những nghiên cứu về chuyển hóa các chất ở tế bào và mô cho chúng ta thấy rằng khi tiêu thụ chất béo vượt quá nhu cầu năng lượng của cơ thể thì chất béo sẽ được tích tụ ở mô mỡ gây béo phì. Như vậy, chế độ ăn giàu chất béo bão hòa là một trong những yếu tố nguy cơ gây lên bệnh béo phì cũng như các bệnh mãn tính liên quan.
Qua đó có thể khẳng định chuột nuôi bằng thức ăn giàu chất béo đã trở thành chuột béo phì về trọng lượng.
Tuy nhiên để có thêm cơ sở khẳng định chế độ dinh dưỡng giàu chất béo có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi lipid và carbohydrate ở chuột, chúng tôi tiến hành xét nghiệm một số chỉ số hóa sinh có liên quan tới rối loạn trao đổi lipid để xác định chuột có thực sự béo phì hay không và kết quả thu được như bảng 3.8.
Bảng 3.8. So sánh một số chỉ số lipid máu giữa chuột nuôi thường