Nguyên tắc:
Phương pháp định lượng protein tổng số chính xác và đơn giản là phương pháp Kjeldahl.
Nguyên tắc: vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc với sự hiện diện của chất xúc tác thích hợp, nitơ có trong mẫu chuyển thành amonium sulfate. Dùng một kiềm mạnh (KOH) đẩy NH3 ra khỏi amonium sulfate (NH4)2SO4
trong máy cất đạm, tạo thành NH3 tự do. NH3 được hấp thu trong dung dịch acid boric. Sau đó định lượng lại amoni tetraborate tạo thành bằng dung dịch acid sulfuric.
Các phản ứng xảy ra trong quá trình: Xúc tác Chất hữu cơ + H2SO4đ (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O 2NH3 + 4H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5H2O H2SO4 + (NH4)2B4O7 + 5 H2O (NH4)2SO4 + 4H3BO3 Tiến hành thí nghiệm:
- Giai đoạn vô cơ hóa: cân khoảng 0,1 g bột đậu nành vào bình Kjeldahl, sau đó thêm 8 mL H2SO4 đậm đặc, và thêm vào 0,7 g chất xúc tác (hỗn hợp chất xúc tác gồm K2SO4: CuSO4: Se (100:10:1). Sau khi cho chất xúc tác vào bình, đem đun sôi trong máy vô cơ hóa Gerhardt đã được nối với hệ thống hấp thu khí độc cho đến khi dung dịch trong bình Kjeldahl trong suốt. Để nguội, ta kiểm tra kết thúc sự vô cơ hóa bằng cách cho vào bình một lượng nhỏ nước cất, rồi lắc nhẹ tráng thành bình, thấy không còn những hạt mụi đen li ti là được. Nếu còn, phải đun tiếp tục cho đến hết.
- Giai đoạn cất đạm: sau khi giai đoạn vô cơ hóa kết thúc, mẫu được đem cất đạm trong máy cất đạm bán tự động. Cho 20 mL axit boric 2% vào bình tam giác, thêm 6 giọt thuốc thử (dung dịch bromocresol xanh và metyl da cam trong alcol), lắp vào vị trí hứng mẫu trên máy. Lắp ống Kjeldahl chứa mẫu đã vô cơ hóa vào hệ thống. Mở hệ thống cất đạm. Sau khi quá trình cất đạm kết thúc, lấy bình tam giác ra khỏi máy sau khi đã tráng nước cất để lấy hết mẫu bám trên ống.
- Giai đoạn chuẩn độ: chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1 N cho đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá sang màu hồng nhạt. Đọc thể tích trên buret.
SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thúy Chuyên ngành Hóa dược
Tính toán kết quả:
Hàm lượng nitơ (g) có trong 100 g mẫu được tính theo công thức: Hàm lượng nitơ tổng số (%) m b a )*100 ( * 0014 , 0
Protein tổng số = Nitơ tổng số x hệ số chuyển đổi Trong đó:
a: thể tích dung dịch H2SO4 dùng chuẩn độ mẫu thật (mL).
b: thể tích dung dịch H2SO4 dùng chuẩn độ mẫu đối chứng (mL). m: khối lượng mẫu đem phân tích (g).
0,0014: số gam nitơ tương đương với 1 mL H2SO4 0,1 N. Hệ số chuyển đổi: 5,71