Khả năng ức chế enzyme trypsin được phương pháp đo quang phổ theo Hamerstrand, G. E. và cộng sự (1981) [27].
Nguyên tắc:
Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme trypsin dựa trên việc sử dụng cơ chất tổng hợp, N-Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride (BAPA) [4, 28, 29]. BAPA là cơ chất tạo màu dưới tác dụng của trypsin tạo thành p-nitroaniline có màu vàng được xác định bằng phương pháp đo màu ở bước sóng 410 nm. Khả năng ức chế enzyme trypsin của dịch chiết đối với cơ chất này được sử dụng để tính lượng trypsin bị ức chế. Giá trị độ hấp thụ của mẫu có và không có dịch chiết đậu nành được sử dụng để tính giá trị đơn vị ức chế trypsin (TI). Hơn nữa, mỗi thử nghiệm đòi hỏi nhiều tỉ lệ pha loãng, sao cho 2 mL dịch chiết sẽ có phần trăm trypsin bị ức chế khoảng 40-60%.
Phương trình phản ứng giữa trypsin và cơ chất BAPA: Trypsin
BAPA N-Benzoyl-DL-arginine + p-Nitroaniline
Tiến hành thí nghiệm:
- Pha hóa chất:
Pha dung dịch đệm Tris –HCl pH 8,2 có chứa CaCl2.2H2O.
Pha dung dịch cơ chất BAPA 0,02 M trong dung dịch đệm Tris –HCl pH 8,2
Pha dung dịch trypsin trong dung dịch HCl 0,001 N. - Tiến hành thí nghiệm:
Cân chính xác 0,2 g bột đậu nành loại béo với ether dầu hỏa trong 12 giờ. Để qua đêm trong tủ lạnh, sau đó rút dịch ra và để khô tự nhiên. Sau đó, cho vào 10 mL dung dịch NaOH 0,01 N, lắc liên tục trong 3 giờ. Điều chỉnh pH dịch chiết khoảng 8,4-10,0. Pha loãng mẫu với tỉ lệ thích hợp, sau cho phần trăm ức chế khoảng 40-60%. Sau đó, lọc qua giấy lọc Whatman No.3 để lấy dịch chiết.
Thực hiện phản ứng trong bể điều nhiệt có lắc ở nhiệt độ 37°C, theo thứ tự:
Bảng 3.3. Xây dựng phản ứng giữa enzyme trypsin và cơ chất PABA Dung dịch chuẩn (blank) Dung dịch chuẩn Dung dịch mẫu (blank) Dung dịch mẫu Nước cất (mL) 0,4 0,4 Dung dịch trypsin (mL) 0,4 0,4 Dịch chiết đậu nành (mL) 0,4 0,4
Vortex đều và ủ ở 37°C trong chính xác 10 phút. Dung dịch BAPA
(mL) 1,0 1,0 1,0 1,0
Vortex đều và ủ ở 37°C trong chính xác 10 phút. Sau đó, dừng phản ứng bằng cách thêm vào acid acetic 30%.
Dung dịch Acid acetic
30% (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2
Dung dịch trypsin
(mL) 0,4 0,4
Mẫu được đo độ hấp thụ ở bước sóng 410 nm với mẫu blank tương ứng.
SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thúy Chuyên ngành Hóa dược Giá trị khả năng ức chế enzyme của đậu nành được thể hiện qua giá trị TI . Được tính theo công thức.
2 1 2 1 * * 1000 * 019 , 0 * * ) ( V m k V A A TI Trong đó:
TI: g trypsin tinh khiết bị ức chế bởi 1 mg mẫu (mg/g). A1: độ hấp thụ của mẫu chuẩn.
A2: độ hấp thụ của mẫu dịch chiết. V1: thể tích dịch chiết ban đầu (mL).
V2: thể tích dịch chiết tham gia phản ứng (mL). k: hệ số pha loãng.
m: khối lượng mẫu (g).
0,019: 1 g trypsin tinh khiết thể hiện hoạt tính tương đương 0,019 đơn vị độ hấp thụ
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN