Hàm lượng acid phytic được xác định bằng phương pháp đo quang phổ theo Gao, Y. và cộng sự (2007) [26].
Nguyên tắc:
Acid phytic được xác định bằng cách sử dụng sắt (III) clorua tạo thành kết tủa sắt phytate [14]. Xác định hàm lượng acid phytic trong thử nghiệm đo màu dựa trên sự giảm cường độ màu của phức Fe3+ - sulfosalicylate (thuốc thử Wade) bởi acid phytic, đây là phương pháp gián tiếp để xác định acid phytic bằng cách xác định lượng dư Fe3+ còn lại trong dung dịch.
Cường độ màu được xác định ở bước sóng 500 nm. Dựa vào đồ thị đường chuẩn của acid phytic với thuốc thử Wade sẽ tính được hàm lượng acid phytic có trong mẫu.
Tiến hành thí nghiệm:
- Pha thuốc thử Wade: 0,03% FeCl3 và 0,3% acid sulfosalicylic. - Dựng đường chuẩn acid phytic
Pha dãy dung dịch phytate chuẩn 0-0,1 mg/mL và các hóa chất theo Bảng. Tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm trên máy quang phổ UV- VIS. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần lấy kết quả trung bình và vẽ đồ thị tương quan giữa nồng độ acid phytic và độ hấp thụ A.
Bảng 3.2. Xây dựng đường chuẩn acid phytic
Nồng độ (mg/mL) 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 DD phytic chuẩn (L) 0 300 600 900 1200 1500 Nước khử ion (L) 1500 1200 900 600 300 0 Thuốc thử Wade (L) 500 500 500 500 500 500 Do acid phytic tạo phức không màu với thuốc thử Wade, nên hàm lượng acid phytic có trong mẫu chính là độ giảm độ hấp thụ của thuốc thử so với mẫu không có acid phytic.
SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thúy Chuyên ngành Hóa dược Cân chính xác 0,5 g bột đậu nành loại béo với ether dầu hỏa trong 12 giờ. Làm khô mẫu, sau đó thêm vào 10 mL HCl 2,4%, lắc liên tục trong 14 giờ. Ly tâm 1000 vòng/phút trong 20 phút, lấy dung dịch phía trên cho vào ống ly tâm khác có chứa sẵn 0,4 g NaCl. Hỗn hợp được lắc ở 310 vòng/phút trong 20 phút, sau đó ủ ở 4°C trong 60 phút. Sau đó, ly tâm hỗn hợp lấy dịch chiết trong.
Mẫu dịch chiết được pha loãng với nước khử ion. Lấy 1,5 mL dịch pha loãng + 0,5 mL thuốc thử Wade, trộn đều. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm.
Tính toán kết quả:
Dựa vào đường chuẩn acid phytic có thể xác định được hàm lượng acid phytic có trong mẫu. Hàm lượng acid phytic có trong mẫu được tính theo công thức: m k V C X * * Trong đó:
X: hàm lượng acid phytic (mg/g).
C: nồng độ acid phytic quy ra từ phương trình đường chuẩn (mg). V: thể tích dịch chiết (mL).
k: hệ số pha loãng.
m: khối lượng mẫu đem phân tích (g).