Phương pháp tạo giống lúa lai hệ “hai dòng” dựa trên cơ sở phát hiện những vật liệu di truyền mới của cây lúa. Đó là những dòng, mà hiện tượng bất dục đực được kiểm tra bởi gen nhân tế bào, loại gen này mẫn cảm với điều kiện môi trường. Các dòng này khi lai với bất kỳ dòng giống nào đều cho con lai F1 hữu dục. Quá trình sản xuất hạt lai F1, được đơn giản hoá, không phải tổ
chức một lần lai để duy trì dòng bất dục. Phổ phục hồi của dòng mẹ rộng, có thể lai xa giữa các loài phụ với nhau nên khả năng tạo ra năng suất rất cao. Tính bất dục của các dòng TGMS và PGMS, không liên quan đến tế bào chất, vì thế ảnh hưởng của kiểu bất dục hoang dại “WA” được khắc phục. Về bản chất di truyền, nhiều tác giả cho rằng tính trạng nhạy cảm điều kiện môi trường của cả hai loại PGMS và TGMS đều do một cặp gen lặn nằm trong nhân kiểm soát và được ký hiệu là pms và tms (Wang và CS 1991 a,b; Maruyama và CS, 1991a; Borkakati và Virmani, 1993).
Hiện nay các nhà khoa học thế giới rất chú trọng đến việc nghiên cứu, sử dụng dòng bất dục đực chức năng di truyền nhân. Nó là công cụ để tạo ra các tổ hợp lai có năng suất cao, chất lượng tốt thích ứng rộng và có khả năng chống chịu với sâu bệnh hại.
2.5.2.1. Khái niệm dòng bất dục đực chức năng di truyền nhân
Dòng bất dục đực chức năng di truyền nhân nhảy cảm với điều kiện môi trường (Enviroments Sensitive Genic Male Sterile EGMS). Đó là những dòng lúa, biểu hiện bất dục đực khi sinh trưởng, phát triển ở điều kiện môi trường nhất định và hữu dục hạt phấn (có thể tự thụ) ở điều kiện khác [25].
Hiện tượng này, lần đầu tiên được phát hiện bởi Shi.M.S (1985), Shi.M.S và Deng.J.Y (1986) [30]. Dạng bất dục này có khả năng phục hồi hạt phấn dưới những điều kiện nhiệt độ và quang chu kỳ nhất định. Trong điều kiện môi trường, hai yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng bất dục và hữu dục hạt phấn, đó là thời gian chiếu sáng trong ngày và nhiệt độ trong giai đoạn phân hoá đòng. Dựa trên phản ứng với hai điều kiện trên, người ta phân thành dòng bất dục đực nhạy cảm với quang chu kỳ và dòng bất dục đực nhảy cảm với nhiệt độ (Yuan.L.P và Xi,Q.F, 1999). Bản chất của hiện tượng này là: do một cặp gen lặn trong nhân điểu khiển và không có liên quan đến gen trong tế bào chất. Do đó, sự phân li ở đời sau của các tổ hợp tuân theo qui luật di truyền của Menden (Borkakati R.P và Virmani S.S, 1996) [26].
2.5.2.2. Phát hiện và nghiên cứu dòng bất dục đực cảm ứng quang chu kỳ
(Photoperiodic – Sensitive Genic Male Sterile).
Năm 1973, theo dõi quần thể lúa Nong ken 58, Shi M.S, đã phát hiện ra một số cá thể bất dục khi trỗ bông trong mùa hè có thời gian chiếu sáng dài trên 14 giờ/ngày. Ông thu chúng về trồng trong nhà lưới và nhận thấy, các chồi mọc sau đó trỗ bông vào mùa thu ( sau 5/9) khi thời gian chiếu sáng dưới 13 giờ 45 phút thì chúng đậu hạt. Đem lai nó với giống khác, thế hệ F1 hữu dục bình thường, nhưng đến thế hệ F2, chúng phân ly tính trạng 3:1 hữu dục và bất dục trong điều kiện ánh sáng ngày dài. Qua quá trình nghiên cứu các nhà khoa học Trung Quốc đã kết luận rằng tính trạng bất dục của dòng lúa nêu trên là do một cặp gen lặn trong nhân điều khiển. Cặp gen này có hai chức năng là điều khiển quá trình hình thành hạt phấn bất dục khi gặp điều kiện pha sáng dài và điều khiển quá trình hình thành hạt phấn hữu dục khi pha sáng ngắn [47],[53].
Năm 1985, các nhà khoa học đã xác định gen gây bất dục đực của giống Nông Ken 58s là gen lặn pms nằm trên nhiễm sắc thể số 2. Lu. X và cộng sự
(Trích theo Phạm Ngọc Lương, 2000) [15], tiến hành lai Nong ken 58s với giống thuộc loài phụ Japonica sau đó để phân ly ở thế hệ F2, họ đã chọn được một số dòng PGMS có gen gây bất dục từ Nong Ken 58s. Một số tác giả khác khi lặp lại thí nghiệm này cũng thu được kết quả tương tự. Yuan L.P (1994) [46] nghiên cứu về tính bất dục đực của dòng Nong Ken 58s và cho biết dòng này cảm ứng mạnh với ánh sáng và cảm ứng yếu với nhiệt độ. Cũng theo Yuan L.P và cộng sự các dòng lúa PGMS mẫn cảm mạnh với ánh sáng từ giai đoạn phân hoá gié cấp 2 đến hình thành tế bào mẹ hạt phấn của đòng non. Thời gian chiếu sáng tới hạn gây hữu dục hạt phấn < 13 giờ 45 phút với cường độ ánh sáng lớn hơn 50 lux [15].
Dòng Nong Ken 58S, là đặc trưng cho dòng bất dục đực dạng PGMS, các dòng bất dục đực này thuộc loài phụ Japonica, bất dục trong điều kiện ngày dài, nhiệt độ cao. Nó đã được phát hiện đầu tiên tại tỉnh Hồ Bắc – Trung Quốc nên còn gọi là dòng HPGMS. Các dòng PGMS có thể nhân duy trì, bằng cách để cho tự thụ trong điều kiện ánh sáng ngày ngắn và sử dụng làm dòng mẹ để sản xuất hạt lai F1 trong điều kiện ánh sáng ngày dài [26].
2.5.2.3. Những kết quả nghiên cứu về dòng bất dục đực cảm ứng nhiệt độ
(Thermo sensitive Genic Male sterile - TGMS).
Năm 1988, Maruyama. K [31] và cộng sự đã nghiên cứu và phát hiện ra dòng TGMS có tên là Annongs thông qua quá trình đột biến tự nhiên. Dòng TGMS này sẽ bất dục nếu ở thời kỳ phân chia tế bào mẹ hạt phấn khi gặp nhiệt độ > 270C và hữu dục nếu nhiệt độ < 240C. Dòng Annongs là dòng TGMS được phát hiện đầu tiên, những dòng bất dục này thuộc loại hình Indica. Chúng có khả năng bất dục trong điều kiện nhiệt độ cao, giới hạn để
chuyển hoá bất dục - hữu dục dao động từ 23-240C (Yuan. L.P,1994) [50]. Năm 1989, Sun.Z.X [40],[41] và cộng sự đã tạo được dòng TGMS có tên là 5460s từ quần thể đột biến của giống lúa IR54. Sau đó năm 1991
Maruyama K.L, và cộng sự (1991) [36] cũng đã tìm được dòng TGMS từ
quần thể đột biến Norin PL-12. Các tác giả trên đều cho rằng, tính trạng bất dục đực dạng TGMS đều do những gen lặn trong nhân điều khiển [49]. Kanoshita. T (1992) [34], đặt tên cho gen TGMS của dòng 5460s và Norin PL-12 là tms-1 và tms-2.
Các dòng TGMS có thể tạo ra bằng phương pháp đột biến nhân tạo, Virmani .S.S và cộng sự (1991) [43], đã thông báo là tạo được dòng TGMS mới bằng đột biến phóng xạ từ giống IR3236 đặt tên là IR3236s. Ngoài ra còn rất nhiều nguồn TGMS khác được tạo ra bằng nhiều phương pháp khác nhau từ nhiều nước trên thế giới. Wang và cộng sự đã tiến hành lai giữa dòng 5460s với Hong wan 52, sau đó phân tích tính di truyền ở thế hệ F2, tìm ra chỉ
thị phân tử liên kết với gen tms, trên cơ sở đó định vị được gen tms nằm trên nhiễm sắc thể số 8. Subudhi. P. K và cộng sự (1995) [38], đã lập bản đồ gen của dòng IR3236s, xác định gen tms-3 nằm trên nhiễm sắc thể số 6. Ngoài ra các tác giả còn tìm được mối liên kết giữa gen tms với các gen của ty thể
trong tế bào chất. Khi nghiên cứu di truyền của dòng TGMS-VN1, có nguồn gốc đột biến từ chiêm bầu Việt Nam, Viện Di Truyền Nông Nghiệp đã xác định được gen tms-4 nằm trên nhiễm sắc thể số 2, không cùng alen với các gen tms có nguồn gốc từ Trung Quốc [14].
Nguyễn Thị Trâm (2000) [25], cho biết: kiểu bất dục đực chức năng di truyền nhân đặc trưng cho loài phụ Indica và dòng Annongs-1, giới hạn để
chuyển hoá từ hữu dục sang bất dục ở nhiệt độ từ 23-260C.
Theo Wu X.J, 1977 [44], việc chuyển hoá hữu dục của dòng Annongs - 1 bị chi phối bới nhiệt độ vào giai đoạn từ 11-15 ngày trước trỗ bông và chịu sự điều khiển của gen lặn tms. Bằng phường pháp lai tạo, người ta đã chuyển được gen này sang các giống khác, tạo được nhiều dòng TGMS mới, các dòng này đang được sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc.
Qua thời gian nghiên cứu Borkakati, 1994 (Trích theo Virmani .S.S, 1996 [42], có kết luận: Trong điều kiện gieo trồng tại Philippin, thời kỳ mẫn cảm với nhiệt độ của dòng TGMS từ 6-15 ngày trước trỗ, thậm trí trong giai đoạn mẫn cảm chỉ cần sử lý một giờ nhiệt độ cao cũng ảnh hưởng đến độ bất dực của hạt phấn.
Yuan L.P và Xi. Q.F, 1995 [51], cho rằng thời kỳ chuyển hoá hữu dục của các dòng TGMS là từ khi hình thành tế bào mẹ hạt phấn đến lúc phân hoá hữu dục của các dòng TGMS được gây ra bởi yếu tố nhiệt độ là chính, độ dài của ánh sáng có ảnh hưởng nhưng không đáng kể.
Theo Nguyễn Thị Trâm, 2000 [25], thời kỳ cảm ứng nhiệt độ của dòng TGMS tương đối ngắn và muộn. Nhiệt độ tới hạn gây bất dục và hữu dục của các dòng rất khác nhau. Có thể minh hoạ sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự
biến đổi chức năng gây hữu dục và bất dục của dòng TGMS như sau:
-BLT: Biological Lower Temperature (Nhiệt độ giới hạn sinh học dưới) -BUT: Biological Upper Temperature (Nhiệt độ giới hạn sinh học trên) - CFP: Critical Fetility Point (Điểm nhiệt độ giới hạn gây hữu dục) - CSP: Critical Sterility Point (Điểm nhiệt độ giới hạn gây bất dục)
Bất dục sinh lý Hữu dục do gen tms điều khiển Chuyển hoá Bất dục do gen tms điều khiển Bất dục sinh lý BLT CFP CSP BUT t0 cao t0 thấp
Sơ đồ trên cho biết: Khi cây lúa sinh trưởng, phát triển trong điều kiện nhiệt độ thấp (dưới giới hạn của nhiệt độ sinh học), dòng TGMS trỗ bông, không đậu hạt được là do chức năng sinh lí bị tổn thương, chứ không phải do cơ chế di truyền. Nếu chúng sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ giới hạn sinh học dưới (BLT) thấp hơn điểm nhiệt độ tới hạn gây hữu dục (CFP) thì sẽ kết hạt bình thường và cho năng suất cao. Nếu dòng TGMS phát triển trong điều kiện nhiệt độ trên điểm tới hạn gây bất dục (CSP) và dưới ngưỡng nhiệt độ giới hạn sinh học trên (BUT) thì nó sẽ bất dục di truyền. Khoảng nhiệt độ giữa CFP và CSP gọi là giới hạn nhiệt độ chuyển hoá, khi mà thời kỳ mẫn cảm của dòng TGMS chịu ảnh hưởng của nhiệt độ
dao động trong khoảng này thì bất dục không hoàn toàn. Vì vậy, khi nhân dòng TGMS phải điều chỉnh cho thời kỳ mẫn cảm không rơi vào nhiệt độ
chuyển hoá để nâng cao năng suất hạt tự thụ. Nếu sản xuất hạt lai, vào thời kỳ
mẫn cảm gặp nhiệt độ ở khoảng này sẽ ảnh hưởng đến chất lượng hạt lai F1. Cũng theo Nguyễn Thị Trâm (2000) [25] dòng TGMS bất dục khi gặp nhiệt độ cao hơn 270C vào thời gian từ 18-12 ngày trước khi lúa trỗ bông, tức là vào thời kỳ phân hoá gié đến phân chia tế bào mẹ hạt phấn trong đòng non. Dòng TGMS chuyển hoá từ bất dục sang hữu dục, khi nhiệt độ giảm xuống dưới 240C, chúng ta có thể lợi dụng đặc điểm này để sản xuất hạt lai F1 trong điều kiện nhiệt độ cao và nhân duy trì dòng TGMS ở điều kiện nhiệt độ thấp.
Để chủ động điều khiển quá trình chuyển hoá từ hữu dục sang bất dục, các nhà khoa học đã dùng nước có nhiệt độ cao (>280C) tưới cho dòng mẹ 4 ngày liên tục vào thời kỳ bắt đầu cảm ứng trong quá trình sản xuất hạt lai F1. Phương pháp này làm cho dòng mẹ có độ bất dục cao, không ảnh hưởng tới độ thuần của hạt lai khi gặp nhiệt độ không khí thấp hơn nhiệt độ gây bất dục (Xiao.G.Y, và cộng sự, 1997) [45]. Trung tâm nghiên cứu lúa lai Hồ Nam, Trung Quốc cho biết: trong quá trình dòng TGMS, dùng nước mát có nhiệt độ
từ 19-210C tưới liên tục vào thời kỳ mẫn cảm, có thể thu được năng suất hạt tự thụ cao (19,1 tạ/ha), ngay cả khi nhiệt độ không khí cao tới 34-350C [45]. Tại Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam, các chuyên gia đã áp dụng việc dùng nước mát lấy từ giếng khoan tưới liên tục cho dòng TGMS ở thời kỳ
mẫn cảm và thu được tỉ lệ kết hạt khá cao. Từ phương pháp này có thể nhân được dòng TGMS trong các mùa vụ thích hợp, kể cả khi có nhiệt độ không khí cao.
Dựa trên cơ sở bản chất di truyền của dòng TGMS, và các tài liệu khí tượng thống kê được trong nhiều năm qua, ở miền Bắc nước ta có hai giai đoạn mà nhiệt độ môi trường có thể phù hợp để nhân dòng TGMS, đó là giai đoạn 10-30/3 và 15-25/10. Dòng TGMS phân hoá vào 2 giai đoạn trên và sẽ
trỗ bông vào giai đoạn tương đối phù hợp, trong đó giai đoạn 10-30/3 là thuận lợi và chắc chắn hơn (Theo Nguyễn Văn Hoan, 2000) [10]. Như vậy, chúng ta có thể bố trí nhân duy trì dòng TGMS trong vụ chiêm xuân và bố trí sao cho lúa trỗ trước ngày 15/4.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng: Giới hạn để gây chuyển hoá hữu dục an toàn ở nước ta là 240C, điều này có nghĩa là trong điều kiện nhiệt độ từ
19-240C, dòng TGMS sẽ hữu dục, nếu nhiệt độ trên 260C dòng TGMS sẽ bất dục hoàn toàn. Những dòng TGMS của trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội: T25s, T27s, T29s, T1s và dòng VN01 của Viện Di truyền Nông nghiệp được tạo ra trong thời gian qua thuộc nhóm này (Nguyễn Văn Hoan, 1999) [18]. Dòng bất dục đực chức năng di truyền nhân (TGMS), Pei ải 64s có nhiệt độ chuyển hoá từ 23,30C đến 25,50C (Doãn Hoa Kỳ, 1996) [23].
Các dòng TGMS khác nhau thì có ngưỡng nhiệt độ chuyển hoá không giống nhau. Giai đoạn mẫn cảm với nhiệt độ của các dòng khác nhau cũng khác nhau. Deng và cộng sự nghiên cứu giai đoạn mẫn cảm với ánh sáng và
nhiệt độ của dòng P(T)GMS trong các năm từ 1990-1996 đã kết luận rằng có 3 kiểu mẫn cảm với nhiệt độ.
- Giai đoạn từ hình thành tế bào mẹ hạt phấn đến phân bào giảm nhiễm. - Giai đoạn từ hình thành nhị đực, nhị cái đến hình thành tế bào mẹ
hạt phấn.
- Từ cuối phân bào giảm nhiễm đến hạt phấn chín.
Đa số các dòng được nghiên cứu có giai đoạn mẫn cảm theo kiểu thứ nhất. Khi nghiên cứu về sản xuất hạt lúa lai F1 hệ 2 dòng tổ hợp bồi tạp sơn thanh (Nguyễn Thạch Cương, 2000) [2] cho biết: Quá trình sản xuất hạt lúa lai F1, phải chủ động về nguồn giống bố mẹ, thực hiện trong vụ mùa và điều khiển để chúng trỗ vào khoảng 25/8-5/9 là tốt nhất.
* Phân loại dòng bất dục các dòng TGMS
Các dòng TGMS có 2 kiểu bất dục hạt phấn sau đây:
- Kiểu thứ nhất: Bất dục điển hình: hạt phấn của kiểu bất dục điển hình có hình dạng giống như dòng CMS có hình dạng không bình thường: hình thoi, hình tam giác, vỏ hạt nhăn nheo, hoàn toàn không tích luỹ tinh bột vì vậy khi nhuộm màu trong dung dịch I-KI 1% không chuyển màu xanh đen. Khi lúa trỗ nhìn vỏ bao phấn có màu xanh vàng nhạt.
- Kiểu thứ 2: Bất dục không hạt phấn: các dòng bất dục không hạt phấn có quá trình diễn biến từ từ khi nhiệt độ tăng cao khoảng 2-3 ngày đầu trong bao phấn còn có hạt phấn bất dục. Sau đó trong bao phấn rỗng hoàn toàn không còn hạt phấn. Khi lúa trỗ nhìn mắt thường thấy bao phấn trắng vì vậy nếu dùng kiểu này để sản xuất hạt lai rất dễ chọn loại bỏ những cá thể hữu dục lẫn vào.
- Dòng TGMS có một số đặc điểm quí khác như: vòi nhụy dài, đầu nhụy to phân ra rất nhiều nhánh. Vì vậy sau khi nở hoa, vở trấu khép lại, đầu nhụy vẫn nằm ngoài vỏ trấu nên những ngày sau vẫn có thể nhận phấn để thụ
tinh. Thời gian nhận phấn của núm nhụy các dòng TGMS tốt nhất vào ngày thứ nhất, thứ 2 sau nở hoa, sau đó tỷ lệ đậu hạt giảm đi nhưng đến ngày thứ 6 vẫn còn khoảng 3-5% núm nhụy có khả năng nhận phấn.
Tỷ lệ núm nhụy thò của các dòng TGMS thường cao hơn các dòng CMS đây là một tính trạng giúp ích cho việc sản xuất hạt lai.
Các dòng TGMS có thể sử dụng tốt trong điều kiện Việt Nam để phát triển lúa lai hai dòng. Hiện nay các dòng này đang được nghiên cứu gây tạo ở