Các nấm đƣợc định danh dựa và sự phát triển của tản nấm trên môi trƣờng, đặc điểm bào tử, kích thƣớc, đính bào đài và đƣợc giám định theo 4 bƣớc của quy tắc Koch (Agrios, 2005). Quy tắc Koch gồm 4 bƣớc sau:
Bƣớc 1: Mô tả triệu chứng và tìm mầm bệnh trong mô bệnh
Mô tả những mẫu mới thu về khi có triệu chứng bệnh rõ ràng về màu sắc, vị trí mô bệnh, đƣờng viền giữa mô bệnh và mô khỏe, lớp nấm trên mô bệnh, các đặc điểm nhƣ mô mềm hoặc cứng, nhũn nƣớc hay khô, lõm hay lồi...
Sau đó nếu trên mô bệnh có sự hiện diện của lớp nấm thì tiến hành làm tiêu bản để xác định tác nhân gây bệnh, ngƣợc lại sẽ tìm mầm bệnh bằng cách ủ mẫu trong bọc nilon có tạo ẩm độ hoặc ủ bằng cách cắt mẫu bệnh (nơi tiếp giáp giữa mô bệnh và mô
20
khỏe) ra từng mảnh nhỏ (0,5 cm2) để trong đĩa petri có chứa giấy thấm và để ở điều kiện
25-300C.
Chụp hình và đo kích thƣớc bào tử bằng phƣơng pháp nuôi cấy trên lame. Đặt một khoanh môi trƣờng WA có kích thƣớc 8 mm và dày 3 mm lên lame đã đƣợc thanh trùng. Sau đó, cấy nấm vào bốn cạnh của khoanh môi trƣờng và đậy lamelle lại, trong đĩa petri có giấy thấm ƣớt để giữ ẩm. Mẫu đƣợc ủ khoảng 3 ngày, sau đó chuyển lamelle sang một lame khác để quan sát. Quan sát mẫu dƣới kính hiển vi quang học bằng nƣớc cất hoặc thuốc nhuộm coton blue. Kích thƣớc bào tử đƣợc đo 30 lần lặp lại, kích thƣớc bào tử đƣợc tính trong khoảng giá trị lớn nhất và giá trị nhỏ nhất và đƣợc tính bằng đơn vị µm. Sau khi quan sát nếu đúng là tác nhân gây bệnh thì tiến hành định danh và trữ nguồn nấm để sử dụng cho những nghiên cứu sau đó.
Bƣớc 2: Phân lập và tách ròng mầm bệnh
Phân lập các tác nhân gây bệnh trên củ cà rốt thu về, sau đó tách ròng làm thuần bằng phƣơng pháp cấy đỉnh sinh trƣởng hay đơn bào tử theo phƣơng pháp của Burgess và ctv. (2009) và cất trữ nguồn nấm cho các thí nghiệm tiếp theo. Quan sát sự phát triển của tản nấm trên môi trƣờng PDA, ghi nhận các chỉ tiêu nhƣ màu sắc, cách mọc trên môi trƣờng, đo đƣờng kính tản nấm trên môi trƣờng PDA ở thời điểm 7 ngày sau nuôi cấy.
Cách phân lập: Chọn những mẫu bệnh có vết bệnh rõ ràng, có thể có sơi nấm phát
triển trên bề mặt mô củ. Cắt thành những mảnh nhỏ 2-3 mm2, cho vào thanh trùng trong
cồn 700 trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tiếp theo rửa lại trong nƣớc cất vô trùng (3 lần) và làm khô bằng giấy thấm thanh trùng. Sau đó cấy mẫu bệnh vào đĩa Petri có chứa môi trƣờng WA. Khi đã cấy mô bệnh trên môi trƣờng WA, tiếp tục tách ròng nguồn nấm sang môi trƣờng PDA cho đến khi có đƣợc nguồn nấm thuần chủng.
Bƣớc 3: Lây nhiễm mầm bệnh đã phân lập vào củ cà rốt khỏe. Quan sát lại triệu chứng bệnh xuất hiện, mô tả kích thƣớc, hình dạng, màu sắc vết bệnh.
Chuẩn bị những củ khỏe, sạch bệnh, rửa sạch bằng nƣớc cất vô trùng, sau đó ngâm trong cồn 70 độ trong 15-20 giây và để khô tự nhiên.
Phƣơng pháp lây bệnh nhân tạo:
Nuôi cấy nguồn nấm cần lây bệnh trong đĩa petri trên môi trƣờng PDA, các dụng cụ sử dụng để lây bệnh nhƣ kim tạo vết thƣơng bó lại thành cụm 4 kim, ống hút, kim chích, nắp nhựa, nắp đĩa petri để gữa cho củ cố định, đều đƣợc thanh trùng.
Dùng pipet hút 10-15 ml nƣớc cất thanh trùng cho vào đĩa và dùng lame đã thanh trùng phân tán bào tử trên đĩa để tạo huyền phù bào tử nấm. Sau đó tiến hành đếm mật
21
số bào tử của huyền phù bằng lame đếm, mật số bào tử dùng để sử dụng lây bệnh nhân
tạo là 106 bào tử/ml. Các củ khỏe đƣợc tạo vết thƣơng bằng bó kim tiêm rồi dùng kim
tiêm hút dung dịch huyền phù nấm bơm lên trên vết thƣơng. Tiếp đó, cho củ vào bọc nilon, dùng mẫu giấy thấm nƣớc cất thanh trùng để tạo ẩm độ, buộc bọc tạo độ phì để tránh tiếp xúc giữa mô củ và bọc nilon. Đặt các mẫu đã lây bệnh ở nhiệt độ 250C. Sau khi lây bệnh tiến hành theo dõi thƣờng xuyên để ghi nhận biểu hiện bệnh trên trái và chụp hình lại ở thời điểm 7 ngày sau khi lây bệnh.
Bƣớc 4: Tái phân lập mầm bệnh và so sánh với mầm bệnh ban đầu.
22
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ CHUNG
Qua công tác thu thập mẫu bệnh tại các chợ Hƣng Lợi, chợ Xuân Khánh, chợ An Nghiệp, siêu thị Coopmart, siêu thị Big C, siêu thị Metro tại thành phố Cần Thơ và giám định tác nhân gây hại trên củ cà rốt sau thu hoạch tại phòng thí nghiệm Phòng trừ sinh học bệnh cây Bộ môn Bảo vệ Thực vật đã đƣợc thực hiện từ tháng 12/2012 đến tháng 10/2013, thời gian thu thập mẫu bệnh dài, là điều kiện thuận lợi cho nhiều loại nấm bệnh phát triển.
Kết quả quan sát các mẫu bị bệnh đã giám định và phân lập đƣợc 7 tác nhân gây hại củ cà rốt sau thu hoạch bao gồm các loại nấm Alternaria radicina, Thielaviopsis sp.,
Fusarium sp., Aspergillus sp., Rhizopus sp., Penicillium sp., Sclerotium sp. Trong đó, đã
xác định nấm Thielaviopsis sp. là một loại nấm ký sinh, xuất hiện hầu hết ở các chợ và
siêu thị trong thành phố Cần Thơ. Đây là loại nấm gây hại khá nặng bởi làm mất giá trị thẩm mỹ của củ cà rốt cũng nhƣ là con đƣờng cho vi khuẩn phát triển. Bệnh thích hợp phát triển ở khu vực có nhiệt độ cao trong các siêu thị cũng nhƣ ở khu vực khô ráo trong các chợ. Các loại nấm còn lại đều là nấm hoại sinh gây hại trên củ. Trong đó nấm
Fusarium sp. và Alternariaradicina xuất hiện ở cả 6 địa điểm thu mẫu, nấm có tỷ lệ gây
hại cao trên cà rốt. Nấm Alternariaradicina gây hại cả trên phần cuống và phần thân của
củ. Đối với nấm Rhizopus sp. và nấm Aspergillus sp. xuất hiện ở các chợ trong khi thu
mẫu. Hai loại nấm còn lại là Penicillium sp. và Sclerotium sp. xuất hiện rãi rác ở 1 hoặc 2 địa điểm thu mẫu (Bảng 3.1).
23
Bảng 3.1: Bảng tổng kết sự hiện diện của các tác nhân gây hại trên cà rốt sau thu hoạch tại các địa điểm thu mẫu
Tác nhân Chợ Siêu Thị An nghiệp Xuân Khánh Hƣng Lợi Coop
Mark Metro BigC
Alternaria radicina x X x x x X Thielaviopsis sp. X x x x X Fusarium sp. x X x x x X Aspergillus sp. x X x Rhizopus sp.. X x Penicillium sp X x Sclerotium sp. X 3.2. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH 3.2.1. Bệnh do nấm Alternaria radicina 3.2.1.1 Triệu chứng bệnh
Sau khi phân lập, làm thuần mầm bệnh từ những mẫu bệnh đƣợc thu thập và chủng lại trên củ cà rốt khỏe, ghi nhận có sự xuất hiện bệnh trên cuống và phần thân trên của củ.
Ở trên cuống, triệu chứng bệnh xuất hiện chậm. Khoảng 3 NSLB, bệnh bắt đầu phát triển. Vết bệnh khô ráo, có sự xuất hiện của các sợi nấm mảnh, tơi và có màu nâu, nâu đen đến đen. Sau đó, vết bệnh có thể phát triển mạnh xuống phần thân, bề mặt vết bệnh có một lớp nấm màu nâu, bông lên dày đặc, phần mô xung quanh hơi lõm xuống, chuyển từ màu vàng cam sang màu đỏ nhạt (Hình 3.1A và B).
Triệu chứng bệnh giống với các mô tả triệu chứng bệnh của Snowden (1991),
Davis (2004) do nấm Alternaria radicina gây bệnh thối đen trên cà rốt sau thu hoạch.
24
Khi quan sát sự phát triển của tản nấm Alternaria sp. trên môi trƣờng PDA ở nhiệt
độ phòng (28-300
C), tốc độ phát triển của sợi nấm chậm. Ban đầu là sự phát triển của hệ sợi nấm mà trắng trên bề mặt môi trƣờng, sau đó chúng tiếp tục phát triển và chuyển sang màu nâu đen đến đen (Hình 3.2E). Tản nấm ngừng phát triển ở giai đoạn 10 NSC và đạt kích thƣớc 6,5 cm. Ở giai đoạn này, mặt trên đĩa Petri tản nấm dạng tròn, màu đen, rìa tản nấm bất dạng, sợi nấm phát triển tạo thành những đƣờng gần giống nhƣ những vòng đồng tâm. Khu vực gần rìa tản nấm có các sợi nấm bong cao, tơi, mảnh, có màu nhạt hơn so với các khu vực còn lại của tản nấm Giai đoạn khoảng 13 NSKC thì khuẩn lạc bắt đầu tiết ra các các sắc tố màu vàng cam trên môi trƣờng. Lƣợng sắc tố nấm tiết ra trên môi trƣờng khá cao. Mặt dƣới đĩa Petri, tản nấm có màu đen (Hình 3.2A và B).
Trên môi trƣờng APDA, tản nấm tốc độ phát triển chậm. Ở mặt trên đĩa Petri, tản nấm phát triển chậm và không đầy đĩa, đạt kích thƣớc tối đa và đạt 4 cm sau 14 ngày nuôi cấy. Rìa khuẩn lạc bất dạng, có màu trắng ngà, phần trung tâm khuẩn lạc sợi nấm nhô cao. Tuy nhiên, nấm không tạo các vòng đồng tâm nhƣ trên môi trƣờng PDA. Nấm sản xuất một lƣợng lớn các sắc tố màu vàng cam trên môi trƣờng. Mặt dƣới đĩa petri, phần trung tâm đĩa có màu nhạt và phần rìa tản nấm có màu đỏ đậm (Hình 3.2C và D). Khoảng 30 NSKC, mặt dƣới tản nấm hình thành các tinh thể dạng cây san hô. Số lƣợng các tinh thể trên môi trƣờng rất hạn chế (Hình 3.2E).
3.2.1.3. Đặc điểm hình thái nấm
Sợi nấm Alternaria radicina có màu nâu, phân nhánh và có vách ngăn. Cuống sinh
bào tử sinh ra trực tiếp từ sợi nấm, màu nâu, phân nhánh, có thể có từ một đến ba điểm sinh bào tử, kích thƣớc từ 2,5-5,0 µm x 7,5-150,0 µm (Hình 3.1C). Bào tử nấm thuộc dạng bào tử đa bào, có màu nâu đến đen, hình dạng bào tử rất khác biệt. Khi còn non, bào tử có thể có dạng từ elip nhọn một đầu đến gần tròn, màu gần nhƣ trong suốt đến màu nhạt, đƣợc sinh ra từ các điểm sinh bào tử. Khi trƣởng thành, bào tử chuyển dần sang màu sậm hơn, bắt đầu hình thành các vách ngăn và vách ngăn dọc; có 2-5 vách ngăn ngang và 1-3 vách ngăn dọc, hình dạng bào tử thay đổi từ hình trứng đến hình chùy. Khi trƣởng thành, bề mặt bào tử có thể sần sùi hoặc trơn láng, kích thƣớc bào tử từ 29-46 µm x 16-27 µm. Đa số các bào tử không có vách ngăn ở tế bào cuối (Hình 3.1 E, F và G). Bào tử có thể mọc đơn lẻ hoặc thành chuỗi trên cành bào đài (Hình 3.1D).
Dựa vào đặc điểm phát triển tản nấm và đặc điểm hình thái của nấm giống với ghi nhận của Ellis và Holiday (1972), Snowden (1991), Barnett và Hunter (1998) thì đây là nấm Alternaria radicina
25
Hình 3.1:Triệu chứng bệnh và đặc điểm của nấm Alternaria radicina
(A và B) triệu chứng bệnh trên thân và cuống của củ cà rốt ở thời điểm 5 ngày sau lây bệnh (C) sợi nấm, cành bào đài và bào tử nấm A. radicina khi quan sát dƣới KHVQH (40X) (D) bào tử nấm đính thành chuỗi trên cành bào đài
(E) bào tử còn non và trƣởng thành của nấm
(F và G) các hình dạng khác nhau của bào tử nấm khi trƣởng thành
A B
C D
26
Hình 3.2:Đặc điểm tản nấm và tinh thể nấm của nấm hình thành trên đĩa Petri
(A và B) mặt trên và mặt dƣới của nấm ở thời điểm 14 NSC trên môi trƣờng PDA (C và D) mặt trên và mặt dƣới của nấm ở thời điểm 30 NSC trên môi trƣờng APDA (E) cách phát triển của nấm trên môi trƣờng PDA
(F) hình dạng tinh thể hình thành trên môi trƣờng APDA
A B
C D
27
3.2.2. Bệnh do nấm Thielaviopsis sp. 3.2.2.1. Triệu chứng bệnh 3.2.2.1. Triệu chứng bệnh
Triệu chứng đầu tiên của bệnh là một đốm màu đen, nhỏ, bất dạng trên bề mặt. Vết đen giống nhƣ một lớp mụi than bám trên củ và có thể xuất hiện ở bất kỳ vị trí nào trên củ. Trên vết bệnh có các khối bào tử của nấm bám dày đặc. Ban đầu vết bệnh có màu xanh đậm, sau đó chuyển dần sang màu đen và một lớp giống nhƣ phấn màu trắng bám lên. Không có sự phân biệt rõ ràng giữa khu vực mô bệnh và mô khỏe. Khi đem ủ mẫu bệnh khoảng 2 ngày, bệnh có thể phát triển lan sang các khu vực khác trên củ và gây đen toàn toàn củ. Trên bề mặt có sự xuất hiện của một lớp giống nhƣ dầu và nấm chỉ gây thối bề mặt(Hình 3.3A và B).
Những đặc điểm trên tƣơng tự với mô tả của Snowden (1991), Davis (2004) và
Koide và ctv. (2007) về triệu chứng bệnh bệnh thối đen củ cà rốt do nấm Thielaviopsis
basicola.
3.2.2.2 Đặc điểm nấm
Sau khi thu mẫu bệnh nhiễm ngoài tự nhiên và quan sát bào tử nấm dƣới kính hiển vi điện tử ta có thể nhận thấy nấm có thể sản xuất 2 loại bào tử: bào tử đính và bào tử áo. Đính bào đài đƣợc sinh ra từ sợi nấm mảnh, mang các bào tử đính nối với nhau thành chuỗi. Các bào tử đính dạng hình trụ dài, hẹp, không màu hoặc màu nhạt với các góc bào tử tròn, mang các giọt lipit với kích thƣớc bào tử 5,45 – 8,75 µm x 25,5 -31,25 µm . Bào tử áo có hai dạng: dạng một là dạng bào tử hậu đính với nhau tạo thành chuỗi dài, màu nâu đến đen, có thể có từ 3-7 vách ngăn. Các vách ngăn này dày hơn so với các vách bên ngoài và có thể tách ra phóng thích các bào tử hậu. Kích thƣớc bào tử hậu của nấm là 7,25 – 10,0 µm x 8,15 – 13,45 µm (Hình 3.3C và D). Dạng hai là các bào tử dạng hình cầu với vách dày, sinh ra đơn lẻ, đƣờng kính trung bình là 7,2 -12,0 µm, có thể quan sát sự nảy mầm của bào tử áo khi quan sát từ các mẫu bệnh thu thập (Hình 3.3E).
Dựa vào đặc điểm bào tử của nấm và so sánh với các tài liệu của Snowden (1991);
Barnett và Hunter (1998); Allah (2011) cho thấy đây là nấm Thielaviopsis basicola gây
28
Hình 3.3: Triệu chứng bệnh và đặc điểm bào tử nấm Thielaviopsis sp.
(A và B) triệu chứng bệnh trên củ cà rốt sau khi ủ mẫu bệnh 2 ngày (C) đặc điểm của nấm khi quan sát dƣới kính hiển vi vật kính 10X (D và E) đính bào đài và bào tử hậu của nấm
A
B C
29
3.2.3 Bệnh do nấm Fusarium sp. 3.2.3.1 Triệu chứng bệnh 3.2.3.1 Triệu chứng bệnh
Bệnh xuất hiện sớm ở thời điểm 3 NSLB và phát triển khá nhanh trên bề mặt củ, vết bệnh đạt đƣờng kính từ 2,5 đến 3,5 cm ở thời điểm 5 NSLB. Triệu chứng bệnh ban đầu là sự phát triển của sợi nấm màu trắng nhô cao trên bề mặt củ, vết bệnh hình tròn hoặc hình oval, bề mặt củ chuyển sang màu sậm hơn. Sau đó, các vết bệnh phát triển lan dần trên bề mặt củ, liên kết với nhau. Tuy nhiên, ở trung tâm vết bệnh thì không có sự xuất hiện của sợi nấm. Phần tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe không rõ ràng. Mô bệnh nhũn nƣớc, mềm, có dịch ứa ra và có mùi hôi (ở thời điểm 5 NSKLB). Khi nấm phát triển trên toàn bộ trái, sợi nấm mọc tơi bông lên trên mô trái và dày đặc, củ thối gần nhƣ hoàn toàn (ở thời điểm 7 NSKLB) (Hình 3.4A).
Những ghi nhận trên tƣơng tự nhƣ ghi nhận của Snowdon (1991); Ramsey và
Wiant (1941) về triệu chứng thối củ cà rốt do nấm Fusarium sp.
3.2.3.2 Đặc điểm tản nấm trên môi trƣờng PDA
Tản nấm sau khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDA ở nhiệt độ phòng (28-300C)
có tốc độ phát triển tƣơng đối nhanh, đạt đƣờng kính 8 cm ở thời điểm 7 NSC. Ở thời điểm 7 NSC, tản nấm là các khoanh nấm màu trắng phát triển nhô cao trên môi trƣờng và thấp dần ra phía rìa, sợi nấm mảnh và tơi, có các vòng đồng tâm rõ ràng, rìa tản nấm tròn đều. Các sợi nấm ở khu vực trung tâm tản nấm bắt đầu chuyển sang màu sậm hơn so với ban đầu. Mặt sau đĩa Petri, tản nấm có màu trắng, có vòng đồng tâm rõ ràng (Hình 3.4B và C).
3.2.3.3 Đặc điểm hình thái nấm
Qua quá trình quan sát dƣới kính hiển vi nhận thấy nấm Fusarium sp. Có một số
đặc điểm nhƣ: sợi nấm không màu, có vách ngăn, phân nhánh. Đính bào đài mọc ra từ
sợi nấm, không màu, thon nhỏ về phía đỉnh, đính mang nhiều bào tử (Hình 3.4D). Nấm