Địa điểm: Thực hiện bố trí thí nghiệm, đo đạc kết quả, xử lý số liệu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 05/8/2013 đến 15/11/2013
3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm
- Máy chụp ảnh (Canon, A800, 10X)
- Cân điện tử Vibra, model DJ-1000TW, độ chính xác 0,01g, Nhật. - Cân điện tử Ohaus, model AR-240, độ chính xác 0,0001 g, Nhật. - Máy đo ẩm Moisture - Analyzer
- Máy ly tâm, model 800 Electronic Centrifuge, Trung Quốc.
- Máy đo pH (Hana pH 212, Trung Quốc, 2 số lẻ, độ chính xác 0,01) - Tủ ủ Sanyo (MIR-262, Nhật)
- Tủ cấy Dalton (Nhật)
- Micropipet P10, P20, P50, P200, P1000 (Gibson, Đức) - Nồi khử trùng nhiệt ƣớt (HVE – 50).
- Máy đo quang phổ Model 722, Trung Quốc
- Dụng cụ thủy tinh thông thƣờng: đĩa petri; ống nghiệm loại 5, 10, 20 mL; que cấy; bình tam giác 250 mL; Eppendorf loại 1,5 mL và 2 mL.
- Các dụng cụ cần thiết khác
3.1.3 Hóa chất sử dụng
- Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) (Trung Quốc) - Magnesium sunfate (MgSO4) (Trung Quốc)
- Sodium chloride (NaCl), (Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%)
- Disodium hydrogen photphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O), (Trung Quốc, độ tinh khiết 99%)
- Tricloroacetid acid (TCA) (Merck, Đức) - Tyrosin
- Thuốc thử Folin
3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu 3.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu
- Bột đậu nành, Công ty TNHH Thiên Ƣng.
- Bột mì đa dụng Meizan, Công ty TNHH XAY LÚA MÌ VIỆT NAM, KCN Mỹ Xuân A, Bà Rịa – Vũng Tàu.
- Cám gạo, Công ty Wilmar Agro Việt Nam.
Nguyên liệu đƣợc bảo quản ở nơi khô ráo, giữ ở độ ẩm cố định 14,0 ± 0,2%.
- Dòng Aspergillus niger S5 đã đƣợc phân lập và xác định tính chất (Trần Thanh Trúc, 2013), cấy truyền trên môi trƣờng PDA thời gian 4 ngày, trữ mẫu ở nhiệt độ thấp (4C) tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ.
3.2.2 Phƣơng pháp phân tích và đo đạc kết quả
Các chỉ tiêu theo dõi trong khảo sát đƣợc tổng hợp trong bảng 3.1
Bảng 3.1: Phƣơng pháp và thiết bị sử dụng để phân tích các chỉ tiêu
TT Chỉ tiêu Phƣơng pháp
[1] Độ ẩm nguyên
liệu (%)
Sấy ở nhiệt độ 105°C đến khối lƣợng không đổi (AOAC 934.06)
[2] Mật số nấm
mốc (cfu/mL)
Đếm khuẩn lạc nấm mốc (cfu/mL) khi ủ trên môi trƣờng Sabouround (Lê Thị Thanh Mai et al., 2009)
[3] Sự hao hụt khối
lƣợng
Xác định bằng cân điện tử Vibra, model DJ-1000TW, độ chính xác 0,01 g
[4] Hoạt tính
protease
Phƣơng pháp Anson cải tiến (Anson, 1938)
[5] Điều chỉnh pH
môi trƣờng
Điều chỉnh bằng dung dịch đệm ở các mức pH khảo sát. Sử dụng pH kế theo tiêu chuẩn ISO 2917 : 1999 (E)
3.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính protease: i. Nguyên tắc:
Phƣơng pháp Ason (Anson, 1938) sử dụng casein là cơ chất phản ứng, sản phẩm tạo thành là các peptide ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosin chiếm đa số. Xác định tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt
tính protease theo định nghĩa. Hoạt tính của protease đƣợc biểu thị là số micromole tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1 mL dung dịch hay 1 mg chế phẩm protease trong thời gian 1 phút ở điều kiện chuẩn (30C, pH 7,6).
ii. Phương pháp tiến hành
Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống mẫu, 3 ống đối chứng. Cách thực hiện đo hàm lƣợng tyrosine của mẫu đƣợc tiến hành theo Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Phƣơng pháp xác định lƣợng tyrosine trong mẫu
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
Mẫu Đối chứng
Casein 1% (mL) 5 5
TCA 10% (mL) 0 5
Dịch enzyme mẫu (mL) 1 0
Lắc đều và giữ ở 30C, trong 30 phút
TCA 10% (mL) 5 0
Dịch enzyme mẫu (mL) 0 1
Lọc, lấy 1 mL dịch lọc thực hiện phản ứng màu
Dịch lọc (mL) 1 1
Dung dịch NaOH 0,5N (mL) 2 2
Thuốc thử Folin 0,6 0,6
Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bƣớc sóng 660 nm
Trong đó:
Dung dịch Na2HPO4 1/15 M: hòa tan 5,9690 g Na2HPO4.12H2O trong nƣớc vừa đủ 250 mL.
Dung dịch KH2PO4 1/15 M : hòa tan 0,9072 g KH2PO4 trong nƣớc đến vừa đủ 100 mL.
Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung 88,5 mL dung dịch Na2HPO4 1/15M với 11,5 mL dung dịch KH2PO4 1/15M đến khi pH đạt 7,6.
Dung dịch casein 1%: pha 1g Casein trong 100 mL dung dịch đệm Sorensen. Dung dịch TCA 10%: hòa tan 10 g TCA trong nƣớc cho đủ 100 mL.
Dung dich NaOH 0,5 N: hòa tan 10 g NaOH trong nƣớc cho đủ 500 mL. Thuốc thử Folin ( pha loãng với nƣớc cất theo tỷ lệ 1:2).
Từ kết quả đo OD và phƣơng trình đƣờng chuẩn tyrosine, số µmol tyrosine đƣợc xác định và tìm ra hoạt tính của protease trong 1 mL dịch trích theo công thức:
x: số µmol tyrosine suy ra từ đƣờng chuẩn
V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11 mL) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1 mL)
K: độ pha loãng mẫu
t: thời gian phản ứng (30 phút)
1 U (Anson) = 1 µmol Tyrosin/mL/phút hoặc 1 U = 1 µmol/mg/phút.
3.2.2.2Phương pháp lên men và trích ly enzyme
Phƣơng pháp lên men, sinh tổng hợp protease từ A. niger: Cân 10 g cơ chất khảo sát trong bình tam giác 250 mL. Làm ẩm cơ chất đến 55% bằng dung dịch muối khoáng với thành phần cố định (yeast extract (0,5%), K2HPO4 (0,4%), NaCl (0,1%), MgSO4 (0,05%)). Thanh trùng các bình tam giác chứa cơ chất ở 121oC trong 15 phút. Làm mát các bình sau khi thanh trùng, bổ sung huyền phù bào tử nấm vào mỗi bình cấy và ủ (Shivakumar, 2012).
Ly trích enzyme:Sau khoảng thời gian lên men, cơ chất lên men đƣợc hòa tan hoàn toàn với 30 mL nƣớc cất. Tiến hành khuấy để ly trích enzyme trong thời gian 30 phút và lọc qua vải mỏng. Tiến hành ly tâm với tốc độ 10.000 rpm ở 4°C trong 10 phút và thu đƣợc phần dịch trong (sau khi loại bỏ phần kết tủa). Phần dịch trong này là dịch trích enzyme thô. Xác định thể tích enzyme thô thu đƣợc (Shivakumar, 2012).
3.2.3 Phƣơng pháp thu thập và xử lý kết quả
Các thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với ít nhất 3 lần lặp lại. Kết quả của thí nghiệm trƣớc đƣợc sử dụng làm thông số cố định cho thí nghiệm kế tiếp.
Số liệu đƣợc thu thập và xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centrution 16.1 và phần mềm Excel. Phân tích phƣơng sai (ANOVA) và kiểm định LSD để kết luận về sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức.
x.V.K t.v Hoạt tính protease (U) =
3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Cơchấtlênmen ← Thí nghiệm 1
Điều chỉnh độ ẩm ← Thí nghiệm 2
Xác định pH ban đầu ← Thí nghiệm 3
Thanh trùng ở 121°C trong 15 phút
Làm nguội Huyền phù A. niger → Cấy nấm mốc (105 cfu/mL)
Ủ theo các khoảng nhiệt độ và thời gian ← Thí nghiệm 4
Thu dịch chứa enzyme để đo đạc hoạt tính protease có trong dịch trích
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của cơ chất đến quá trình len men sinh tổng hợp protease trên môi trƣờng rắn SSF sinh tổng hợp protease trên môi trƣờng rắn SSF
Mục đích: Tìm ra loại cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease đạt hiệu quả cao. Kết quả này đƣợc sử dụng làm thông số cố định cho các thí nghiệm sau.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố. Nhân tố A: Cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp protease
A1: Bột đậu nành A2: Cám gạo A3: Bột mì
Tổng số nghiệm thức: 3 nghiệm thức
Nhân tố cố định: Độ ẩm môi trƣờng (60%), huyền phù bào tử nấm bổ sung là 1 mL (với mật số nấm mốc 105 bào tử/mL), nhiệt độ ủ 30°C, thời gian ủ 72 giờ.
Tiến hành thí nghiệm:
Lên men: Cân 10 g môi trƣờng cho vào các bình tam giác 250 mL, làm ẩm cơ chất bằng dung dịch muối khoáng (bao gồm: yeast extract 0,5%, KH2PO4 0,4%, NaCl 0,1% và MgSO4 0,05%) đến 55%. Thanh trùng các bình tam giác chứa cơ chất ở 1210C trong 15 phút. Làm mát các bình sau khi thanh trùng, cho 1 mL huyền phù bào tử nấm (với mật số nấm mốc 105 bào tử/mL) vào 3 môi trƣờng trên ở, ủ ở nhiệt độ phòng (30°C), thời gian ủ 72 giờ. Sau khi ủ đủ thời gian, trích lấy dịch chứa enzyme thô và xác định hoạt tính.
Ly trích enzyme: Dịch chứa protease đƣợc ly trích bằng cách sử dụng 30 mL nƣớc cất (pH 6,7 ÷ 6,8) cho vào bình mẫu sau khi ủ, tiến hành khuấy để ly trích enzyme trong thời gian 30 phút. Tiến hành ly tâm ở 4°C, tốc độ 10000 rpm thu đƣợc phần dịch trong (sau khi loại bỏ phần kết tủa) là dịch trích enzyme thô. Xác định thể tích enzyme thô thu đƣợc. Đo hoạt tính protease trong enzyme thô (U/mL dịch trích), từ đó xác định hoạt tính protease tƣơng ứng với nghiệm thức khảo sát (U/g cơ chất) theo công thức:
Hoạt tính protease thu đƣợc (U/g):
m V C
C 0
Với:
C0: Hoạt tính protease trong 1 mL dịch trích V: Thể tích dịch trích (mL)
m: Khối lƣợng cơ chất chính trƣớc khi lên men (g)
Hoạt tính enzyme protease đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Anson.
Kết quả thu nhận: Cơ chất thích hợp cho quá trình lên men cho hoạt tính protease cao nhất đƣợc chọn làm thông số cố định cho các thí nghiệm sau.
3.3.3 Thí nghiệm 2 : Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng đến khả năng thu nhận protease có hoạt tính cao từ Aspergillus niger thu nhận protease có hoạt tính cao từ Aspergillus niger
Mục đích: Xác định ảnh hƣởng của các độ ẩm khác nhau đến hiệu quả thu nhận protease.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc khảo sát với 1 nhân tố Nhân tố B: Độ ẩm (%)
B1: 50% B2: 55% B3: 60% B4: 65% B5 : 70% Số nghiệm thức: 5 nghiệm thức
Tiến hành thí nghiệm: Khảo sát đƣợc tiến hành dựa trên kết quả tối ƣu từ thí nghiệm trƣớc. Thành phần cơ chất và dinh dƣỡng thích hợp cho hoạt động của protease đƣợc chuẩn bị. Điều chỉnh độ ẩm cơ chất đến 50%, 55%, 60%, 65%, 70% bằng dung dịch muối khoáng. Thanh trùng các bình tam giác chứa cơ chất ở 1210
C trong 15 phút. Làm mát các bình sau khi thanh trùng, cho 1 mL huyền phù bào tử nấm (với mật số nấm mốc 105 bào tử/mL) vào các bình mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng (30°C), thời gian ủ 72 giờ.Quá trình ly trích enzyme vẫn sử dụng 30 mL nƣớc. Tiến hành ly tâm ở 4C, tốc độ 10000 rpm trong 10 phút. Xác định thể tích enzyme thô và đo hoạt tính bằng phƣơng pháp Anson.
Kết quả thu nhận: Độ ẩm thích hợp giúp quá trình lên men ổn định và thu nhận hoạt tính protease (U/g) cao nhất đƣợc chọn làm thông số cố định cho các thí nghiệm sau.
3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ban đầu đến quá trình sinh tổng hợp protease trình sinh tổng hợp protease
Mục đích: Xác định giá trị pH ban đầu của môi trƣờng ảnh hƣởng đến hoạt lực protease tích lũy đƣợc.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên gồm một nhân tố với ba lần lặp lại.
Nhân tố C: pH ban đầu của dung dịch đệm sử dụng để điều chinh độ ẩm môi trƣờng lên men
C1: 3 C2: 4 C3: 5
C4: 6 C5 :7 C6 :8
Tổng số nghiệm thức: 6 nghiệm thức
Tiến hành thí nghiệm : Thí nghiệm đƣợc tiến hành dựa trên các thông số tối ƣu từ các thí nghiệm trƣớc. Tiến hành làm ẩm cơ chất bằng 10 mL nƣớc muối khoáng ứng với các giá trị của pH trên. Sau đó cấy 1 mL huyền phù bào tử nấm vào các bình mẫu. Mẫu khảo sát đƣợc tiến hành lên men ở tủ ủ có nhiệt độ phòng trong 72 giờ. Tiến hành trích ly nhƣ các thí nghiệm trƣớc. Thu dịch chứa enzyme tƣơng ứng với từng mức pH khảo sát để đo đạc hoạt tính protease có trong dịch trích.
Kết quả thu nhận: pH thích hợp cho quá trình lên men nhằm thu nhận protease hoạt tính cao nhất đƣợc chọn làm thông số cố định cho các thí nghiệm sau.
3.3.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian ủ đến quá trình tổng hợp protease ở các nhiệt độ khác nhau hợp protease ở các nhiệt độ khác nhau
Mục đích: Xác định hiệu quả sinh tổng hợp protease theo thời gian và nhiệt độ nuôi ủ A. niger trong điều kiện lên men SSF.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên gồm hai nhân tố. Nhân tố D: Thời gian ủ, giờ
D0: 24 giờ D1: 48 giờ D2: 72 giờ
D3: 96 giờ D4: 120 giờ
Nhân tố E: Nhiệt độ ủ, C
E1: 28C E2: 31C
E3: 34C E4: 37C
Số nghiệm thức: 20 nghiệm thức
Tiến hành thí nghiệm: Khảo sát đƣợc thực hiện dựa trên kết quả tối ƣu của thí nghiệm trƣớc. Sau thời gian ủ tƣơng ứng 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ ở các nhiệt độ khảo sát, trích lấy dịch chứa enzyme và xác định hoạt tính.
Kết quả thu nhận: Nhiệt độ và thời gian thích hợp nhất cho quá trình lên men sinh protease (U/g) có hoạt tính cao.
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 ẢNH HƢỞNG CỦA CƠ CHẤT LÊN MEN ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE TỔNG HỢP PROTEASE
Đối với mỗi vi sinh vật, khả năng sinh tổng hợp protease thay đổi rất nhiều tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy. Môi trƣờng nuôi cấy giàu protein là cơ chất có hiệu quả cho việc thúc đẩy quá trình lên men sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao từ nấm mốc. Bột đậu nành, bột mì, cám gạo là ba nguồn cơ chất giàu protein gần gũi, dễ tìm, giá thành thấp thích hợp cho việc nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp enzyme protease. Hiệu quả của quá trình sinh tổng hợp protease đƣợc thu nhận từ nấm mốc đƣợc đánh giá thông qua hoạt tính protease. Kết quả đo hoạt tính protease đƣợc thu nhận từ nấm mốc (dòng Aspergillus niger S5) khi tiến hành lên men từ ba nguồn cơ chất trên đƣợc tổng hợp ở bảng 4.1.
Bảng 4.1: Hoạt tính protease thu đƣợc từ ba nguồn cơ chất lên men
Nguyên liệu Hoạt tính protease (U/g)
Bột đậu nành 0,086a 0,008
Bột mì 0,039b 0,018
Cám gạo 0,053b 0,013
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo phép kiểm định LSD ở độ tin cậy 95%
Từ kết quả thu đƣợc ở bảng 4.1 có thể nhận thấy, hoạt tính protease thu nhận đƣợc qua quá trình lên men từ cơ chất bột đậu nành cho hoạt tính cao nhất 0,086 ± 0,008 U/g hơn 1,6 lần khi sử dụng cám gạo làm cơ chất lên men. Môi trƣờng bột mì cho hoạt tính protease khá thấp (0,039 0,018 U/g). Điều này có lẽ là do protein của đậu nành là cơ chất thích hợp nhất cho hoạt động của dòng nấm mốc khảo sát. Hơn thế nữa, khi tiến hành thanh trùng, bột mì bị hồ hóa, dẫn đến khoảng quá trình trao đổi khí giảm, hoạt động của nấm mốc trong môi trƣờng có độ thoáng khí thấp trở nên khó khăn hơn. Đây có lẽ là nguyên nhân dẫn đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm mốc trên môi trƣờng bột mì chậm và hoạt tính protease thu nhận không cao.
Haq et al. (2004) đã khẳng định đƣợc bột đậu nành là sản phẩm nông nghiệp tốt nhất có khả năng sử dụng nhƣ cơ chất chính cho việc sản xuất protease từ
Penicillium griseoroseum. Nghiên cứu của Irfan et al. (2011) cũng đã xác nhận hiệu quả thu nhận protease từ nấm mốc A. niger với cơ chất là bột đậu nành.
Nhƣ vậy, bột đậu nành là cơ chất thích hợp cho nấm mốc phát triển và sinh tổng hợp protease cho hoạt tính cao.
4.2 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ ẨM MÔI TRƢỜNG LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG TỔNG HỢP PROTEASE HOẠT TÍNH CAO NĂNG TỔNG HỢP PROTEASE HOẠT TÍNH CAO
Độ ẩm của môi trƣờng lên men đƣợc biết đến là một trong những yếu tố quan trọng nhất có ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng và tổng hợp enzyme từ vi sinh vật (Tewari et al., 2005). Đối với quá trình nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp các enzyme thủy phân nói chung và protease nói riêng, việc điều chỉnh độ ẩm môi trƣờng thƣờng đƣợc tiến hành với nƣớc cất (Joshi et al., 2006).
Dựa trên các tài liệu tham khảo và các thí nghiệm thăm dò, thí nghiệm điều chỉnh môi trƣờng ở các độ ẩm 50%, 55%, 60%, 65%, 70% đƣợc tiến hành. Hoạt tính protease thu nhận tƣơng ứng với các nghiệm thức khảo sát đƣợc thể hiện ở bảng