Các chỉ tiêu theo dõi trong khảo sát đƣợc tổng hợp trong bảng 3.1
Bảng 3.1: Phƣơng pháp và thiết bị sử dụng để phân tích các chỉ tiêu
TT Chỉ tiêu Phƣơng pháp
[1] Độ ẩm nguyên
liệu (%)
Sấy ở nhiệt độ 105°C đến khối lƣợng không đổi (AOAC 934.06)
[2] Mật số nấm
mốc (cfu/mL)
Đếm khuẩn lạc nấm mốc (cfu/mL) khi ủ trên môi trƣờng Sabouround (Lê Thị Thanh Mai et al., 2009)
[3] Sự hao hụt khối
lƣợng
Xác định bằng cân điện tử Vibra, model DJ-1000TW, độ chính xác 0,01 g
[4] Hoạt tính
protease
Phƣơng pháp Anson cải tiến (Anson, 1938)
[5] Điều chỉnh pH
môi trƣờng
Điều chỉnh bằng dung dịch đệm ở các mức pH khảo sát. Sử dụng pH kế theo tiêu chuẩn ISO 2917 : 1999 (E)
3.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính protease: i. Nguyên tắc:
Phƣơng pháp Ason (Anson, 1938) sử dụng casein là cơ chất phản ứng, sản phẩm tạo thành là các peptide ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosin chiếm đa số. Xác định tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt
tính protease theo định nghĩa. Hoạt tính của protease đƣợc biểu thị là số micromole tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1 mL dung dịch hay 1 mg chế phẩm protease trong thời gian 1 phút ở điều kiện chuẩn (30C, pH 7,6).
ii. Phương pháp tiến hành
Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống mẫu, 3 ống đối chứng. Cách thực hiện đo hàm lƣợng tyrosine của mẫu đƣợc tiến hành theo Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Phƣơng pháp xác định lƣợng tyrosine trong mẫu
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
Mẫu Đối chứng
Casein 1% (mL) 5 5
TCA 10% (mL) 0 5
Dịch enzyme mẫu (mL) 1 0
Lắc đều và giữ ở 30C, trong 30 phút
TCA 10% (mL) 5 0
Dịch enzyme mẫu (mL) 0 1
Lọc, lấy 1 mL dịch lọc thực hiện phản ứng màu
Dịch lọc (mL) 1 1
Dung dịch NaOH 0,5N (mL) 2 2
Thuốc thử Folin 0,6 0,6
Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bƣớc sóng 660 nm
Trong đó:
Dung dịch Na2HPO4 1/15 M: hòa tan 5,9690 g Na2HPO4.12H2O trong nƣớc vừa đủ 250 mL.
Dung dịch KH2PO4 1/15 M : hòa tan 0,9072 g KH2PO4 trong nƣớc đến vừa đủ 100 mL.
Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung 88,5 mL dung dịch Na2HPO4 1/15M với 11,5 mL dung dịch KH2PO4 1/15M đến khi pH đạt 7,6.
Dung dịch casein 1%: pha 1g Casein trong 100 mL dung dịch đệm Sorensen. Dung dịch TCA 10%: hòa tan 10 g TCA trong nƣớc cho đủ 100 mL.
Dung dich NaOH 0,5 N: hòa tan 10 g NaOH trong nƣớc cho đủ 500 mL. Thuốc thử Folin ( pha loãng với nƣớc cất theo tỷ lệ 1:2).
Từ kết quả đo OD và phƣơng trình đƣờng chuẩn tyrosine, số µmol tyrosine đƣợc xác định và tìm ra hoạt tính của protease trong 1 mL dịch trích theo công thức:
x: số µmol tyrosine suy ra từ đƣờng chuẩn
V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11 mL) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1 mL)
K: độ pha loãng mẫu
t: thời gian phản ứng (30 phút)
1 U (Anson) = 1 µmol Tyrosin/mL/phút hoặc 1 U = 1 µmol/mg/phút.
3.2.2.2Phương pháp lên men và trích ly enzyme
Phƣơng pháp lên men, sinh tổng hợp protease từ A. niger: Cân 10 g cơ chất khảo sát trong bình tam giác 250 mL. Làm ẩm cơ chất đến 55% bằng dung dịch muối khoáng với thành phần cố định (yeast extract (0,5%), K2HPO4 (0,4%), NaCl (0,1%), MgSO4 (0,05%)). Thanh trùng các bình tam giác chứa cơ chất ở 121oC trong 15 phút. Làm mát các bình sau khi thanh trùng, bổ sung huyền phù bào tử nấm vào mỗi bình cấy và ủ (Shivakumar, 2012).
Ly trích enzyme:Sau khoảng thời gian lên men, cơ chất lên men đƣợc hòa tan hoàn toàn với 30 mL nƣớc cất. Tiến hành khuấy để ly trích enzyme trong thời gian 30 phút và lọc qua vải mỏng. Tiến hành ly tâm với tốc độ 10.000 rpm ở 4°C trong 10 phút và thu đƣợc phần dịch trong (sau khi loại bỏ phần kết tủa). Phần dịch trong này là dịch trích enzyme thô. Xác định thể tích enzyme thô thu đƣợc (Shivakumar, 2012).