Haq et al. (2004) đã khẳng định đƣợc bột đậu nành là sản phẩm nông nghiệp tốt nhất có khả năng sử dụng nhƣ cơ chất chính cho việc sản xuất protease từ
Penicillium griseoroseum. Ngoài ra, cám gạo và bột hƣớng dƣơng cũng đƣợc sử dụng làm cơ chất lên men cho dòng nấm Rhizopus oligosporous trong quá trình sản xuất protease (Ikasari và Mitchell, 1994; Haq et al., 2003). Chakraborty et al.
(2000) cũng đã nghiên cứu sản xuất của protease từ A. niger với cám lúa mì đƣợc sử dụng nhƣ một chất nền.
Protease ƣa acid đƣợc sản xuất bởi một số loài Aspergillus bao gồm
A. oryzae (Narahara et al., 1982), A. niger và A. sojae (Chakraborty et al., 2000; Yang và Hsing, 1998). Tuy nhiên dòng nấm sợi A. niger (Heneri et al., 1988)và A. flavus cũng sản xuất protease kiềm (Malathi và Chakraborty, 1991).
Paranthaman et al. (2009) tiến hành nghiên cứu so sánh việc sử dụng các cơ chất khác nhau (từ các giống khác nhau) của gạo tấm (PONNI, IR-20, CR-1009, ADT- 36 và ADT-66) để sản xuất protease đối với A. niger. Sau quá trình SSF, PONNI cho hoạt tính protease cao nhất với 67,7 U/g và ADT-66 sản xuất protease với hoạt tính thấp nhất là 44,7 U/g. Các điều kiện tối ƣu để sản xuất protease là: ủ ở 35°C, 96 giờ và pH 7,0.
Aspergillus niger đƣợc phân lập từ đất bùn thu thập từ Lahore đã đƣợc chứng minh có khả năng sinh protease thông qua quá trình SSF. Quá trình tổng hợp enzyme đạt hiệu quả tốt nhất khi điều chỉnh thành phần môi trƣờng lên men là cám lúa mì và đậu tƣơng nhƣ nguồn cung cấp carbon và nitrogen ở tỷ lệ tƣơng ứng là 8:2 trong 48 giờ ủ ở nhiệt độ 30°C và pH 3,0 (Qazi et al., 2008).
Radha (2012) đƣa ra thông tin về các điều kiện tối ƣu hóa trong quá trình sinh protease ƣa acid của Aspergillus SPS trên cơ chất lúa mì Rawa. Các giá trị tối ƣu của các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh proease acid đã đƣợc tìm thấy với độ ẩm 60% (v/w), nhiệt độ ủ 32 ± 2°C, thời gian ủ 5 ngày và pH 5,0. Bên cạnh đó, việc ứng dụng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng trong tối ƣu hóa quá trình lên men sinh tổng hợp protease từ A. oryzae cũng đƣợc áp dụng (Deepak et al., 2008 ; Gerritse et al., 2007).
Ở Việt Nam, một số nghiên cứu về tổng hợp protease từ vi sinh vật cũng đã đƣợc công bố. Đỗ Thị Bích Thủy (2012) đã tìm ra một số điều kiện ảnh hƣởng đến khả năng thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của dòng Bacillus amyloliquefaciens
N1, phân lập từ nem chua Huế, nhƣ thành phần môi trƣờng, nhiệt độ nuôi cấy, pH ban đầu và thời gian lên men đã đƣợc nghiên cứu. Kết quả cho thấy rằng tinh bột hòa tan là nguồn carbon bổ sung vào môi trƣờng cơ bản (MTCB), có chứa 1% peptone, 0,3% cao thịt và 0,5% NaCl, làm cho quá trình thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của B. amyloliquefaciens N1 tốt nhất; hoạt độ protease trong môi trƣờng nuôi cấy đạt đƣợc 0,758 HP/mL, lớn hơn so với mẫu đối chứng (0,613 HP/mL) 1,2 lần. Trong tất cả các nguồn nitrogen bổ sung vào MTCB, chỉ có casein làm cho hoạt độ protease (0,758 HP/mL) cao hơn mẫu đối chứng (0,511 HP/mL). Các thí nghiệm có bổ sung kết hợp các nguồn nitrogen và carbon vào môi trƣờng nuôi cấy, hoạt độ protease không tăng so với khi khảo sát ảnh hƣởng riêng rẽ nguồn tinh bột. Trên cơ sở khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng tinh bột (0,25÷1,75%) đến khả năng sinh tổng hợp protease của dòng này, hoạt độ quan sát đạt đƣợc giá trị cao nhất (0,760 HP/mL) ở hàm lƣợng tinh bột 0,75%. Đồng thời, hoạt độ protease đạt cao nhất khi nuôi cấy trong môi trƣờng thích hợp với pH ban đầu bằng 8 và nhiệt độ 35°C. Thời gian thu nhận enzyme thích hợp nhất khi nuôi cấy dòng này trong các điều kiện trên là 32 giờ với hoạt độ đạt đƣợc là 0,777 HP/mL.
Trƣớc đó, Quyền Đình Thi et al. (2007) cũng đã nghiên cứu tối ƣu một số điều kiện nuôi cấy Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp protease. Kết quả khảo sát cho thấy, hoạt tính protease đạt tối đa khi dòng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB ở pH 7,0 bổ sung 20% (v/w) nƣớc biển ở nhiệt độ 30°C và thời gian ủ 48 giờ.
Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nƣớc ở lĩnh vực tuyển chọn dòng vi sinh vật phù hợp cho hoạt động của enzyme đặc hiệu (protease) đến việc tối ƣu hóa quá trình sinh tổng hợp enzyme này, một số vấn đề cơ bản cần quan tâm là:
- Hoạt tính của protease thu nhận phụ thuộc vào dòng vi sinh vật đặc hiệu – chịu sự chi phối của điều kiện môi trƣờng sinh trƣởng. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu protease chỉ thƣờng đƣợc thực hiện trên đối tƣợng vi khuẩn (Bacillus sp.), trong khi việc sử dụng dòng nấm sợi, điển hình là A.niger trong nuôi cấy protease đƣợc áp dụng rất rộng rãi trên thế giới. Các ngân hàng giống vi sinh vật ở Việt Nam cũng không có giống đặc hiệu riêng cho protease.
- Các thông số kỹ thuật của quá trình lên men, sinh tổng hợp protease phụ thuộc vào từng dòng vi sinh vật khảo sát - cần phải đƣợc xác định cụ thể theo thực nghiệm. Chính vì vậy, việc thăm dò các điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho quá trình tổng hợp enzyme protease của dòng Aspergillus niger bản địa đƣợc thực hiện.
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm