sinh tổng hợp protease trên môi trƣờng rắn SSF
Mục đích: Tìm ra loại cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease đạt hiệu quả cao. Kết quả này đƣợc sử dụng làm thông số cố định cho các thí nghiệm sau.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố. Nhân tố A: Cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp protease
A1: Bột đậu nành A2: Cám gạo A3: Bột mì
Tổng số nghiệm thức: 3 nghiệm thức
Nhân tố cố định: Độ ẩm môi trƣờng (60%), huyền phù bào tử nấm bổ sung là 1 mL (với mật số nấm mốc 105 bào tử/mL), nhiệt độ ủ 30°C, thời gian ủ 72 giờ.
Tiến hành thí nghiệm:
Lên men: Cân 10 g môi trƣờng cho vào các bình tam giác 250 mL, làm ẩm cơ chất bằng dung dịch muối khoáng (bao gồm: yeast extract 0,5%, KH2PO4 0,4%, NaCl 0,1% và MgSO4 0,05%) đến 55%. Thanh trùng các bình tam giác chứa cơ chất ở 1210C trong 15 phút. Làm mát các bình sau khi thanh trùng, cho 1 mL huyền phù bào tử nấm (với mật số nấm mốc 105 bào tử/mL) vào 3 môi trƣờng trên ở, ủ ở nhiệt độ phòng (30°C), thời gian ủ 72 giờ. Sau khi ủ đủ thời gian, trích lấy dịch chứa enzyme thô và xác định hoạt tính.
Ly trích enzyme: Dịch chứa protease đƣợc ly trích bằng cách sử dụng 30 mL nƣớc cất (pH 6,7 ÷ 6,8) cho vào bình mẫu sau khi ủ, tiến hành khuấy để ly trích enzyme trong thời gian 30 phút. Tiến hành ly tâm ở 4°C, tốc độ 10000 rpm thu đƣợc phần dịch trong (sau khi loại bỏ phần kết tủa) là dịch trích enzyme thô. Xác định thể tích enzyme thô thu đƣợc. Đo hoạt tính protease trong enzyme thô (U/mL dịch trích), từ đó xác định hoạt tính protease tƣơng ứng với nghiệm thức khảo sát (U/g cơ chất) theo công thức:
Hoạt tính protease thu đƣợc (U/g):
m V C
C 0
Với:
C0: Hoạt tính protease trong 1 mL dịch trích V: Thể tích dịch trích (mL)
m: Khối lƣợng cơ chất chính trƣớc khi lên men (g)
Hoạt tính enzyme protease đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Anson.
Kết quả thu nhận: Cơ chất thích hợp cho quá trình lên men cho hoạt tính protease cao nhất đƣợc chọn làm thông số cố định cho các thí nghiệm sau.