Sự thay đổi hoạt tính protease theo thời gian ủ tƣơng ứng từng nhiệt độ

Quá trình sinh tổng hợp enzyme phụ thuộc rất lớn vào sự phát triển của tế bào nấm mốc nên thời gian nuôi cấy hay thời điểm thu nhận chế phẩm enzyme là một trong những nhân tố quan trọng quyết định hoạt tính của enzyme. Nhiệt độ nuôi cấy cũng ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình nuôi cấy và khả năng sinh enzyme của vi sinh vật. Do đó, thí nghiệm đƣợc tiến hành khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy nấm mốc

A.niger (24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ) ở các nhiệt độ khác nhau (28C, 31C, 34C, 37C) nhằm tìm ra thời điểm và nhiệt độ mà nấm mốc phát triển tối ƣu cho hiệu quả sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao. Kết quả đo hoạt tính protease thay đổi theo thời gian ủ và nhiệt độ đƣợc tổng hợp ở bảng 4.4.

Bảng 4.4: Sự thay đổi hoạt tính protease theo thời gian ủ ở các nhiệt độ khác nhau

Thời gian ủ (giờ) 28C 31C 34C 37C

24 0,015a 0,006 0,045a 0,001 0,036a 0,003 0,026a 0,003

48 0,060b 0,005 0,062b 0,009 0,048a 0,019 0,041a 0,001

72 0,109c 0,010 0,126d 0,012 0,780b 0,021 0,730b 0,006

96 0,080b 0,009 0,085c 0,010 0,055ab 0,006 0,051ab 0,002

120 0,067b 0,011 0,069b 0,002 0,048a 0,002 0,044a 0,001

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo phép kiểm định LSD ở độ tin cậy 95%

Dựa vào kết quả ở bảng 4.4 nhận thấy, hoạt tính protease có sự khác biệt đáng kể ở các mức thời gian khác nhau khi tiến hành nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau. Nhìn chung, hoạt tính của enzyme thu đƣợc đều tăng dần khi thời gian ủ kéo dài đến 72 giờ ở các mức nhiệt độ khác nhau 28C, 31C, 34C, 37C. Tuy nhiên, hoạt tính bắt đầu giảm khi thời gian nuôi cấy tăng từ 72 giờ đến 120 giờ. Hoạt tính enzyme thu đƣợc liên quan chặt chẽ đến sự phát triển của tế bào nấm mốc. Trong 24 giờ sau khi cấy, nấm mốc A. niger đang dần thích nghi với điều kiện môi trƣờng nên chƣa gia tăng mật số đáng kể. Vì thế, việc thu chế phẩm enzyme ở thời điểm này là quá sớm khiến cho enzyme chƣa đƣợc tổng hợp nhiều, protease thu đƣợc có hoạt tính khá thấp so với các thời gian khác ở cùng nhiệt độ. Hoạt tính thu đƣợc ở nhiệt độ 28C, 31C, 34C, 37C chỉ đạt lần lƣợt là 0,018  0,006 U/g, 0,045  0,001 U/g, 0,036  0,003 U/g và 0,026  0,003 U/g. Sau 24 giờ nuôi cấy, nấm mốc bắt đầu gia tăng mật số, thúc đẩy sự tổng hợp protease, hoạt tính của enzyme gia tăng (Patil et al., 2006).

Thời gian để nấm mốc phát triển tối ƣu, sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao nhất là 72 giờ nuôi ủ, tƣơng ứng với hoạt tính protease thu đƣợc là 0,109  0,010 U/g ở 28C , 0,126  0,012 U/g ở 31C , 0,780  0,021 U/g ở 34C và ở 37C là 0,730  0,006 U/g. Kết quả này tƣơng đồng với nghiên cứu của Karuna và Ayyana (1993); Ikasari và Mitchell (1994) trên dòng Rhizopus oligosporus. Samarntarn et al. (1999) cũng tìm thấy thời gian ủ tối ƣu giúp thu nhận protease khi tiến hành nuôi cấy A. oryzae U1521 là 72 giờ. Ikram et al. (2006) cũng nói rằng thời gian ủ 72 giờ là tối ƣu cho sản xuất protease từ Penicillium chrysogenum.

Sau thời gian ủ tối ƣu (trƣờng hợp khảo sát là 72 giờ), môi trƣờng sẽ cạn dần chất dinh dƣỡng, quá trình tăng trƣởng của nấm mốc giảm dần, kéo theo sự sinh tổng hợp enzyme hầu nhƣ ngừng lại nên hoạt tính enzyme thu đƣợc thấp (Grebechova et al., 2007). Nếu tiếp tục kéo dài thời gian nuôi cấy, thì hoạt tính protease sẽ giảm xuống. Nhƣ vậy, thời gian ủ nấm mốc thích hợp nhất nhằm thu đƣợc protease có hoạt tính cao là 72 giờ trong điều kiện nhiệt độ trong khoảng từ 28÷34o

C trong điều kiện nuôi cấy trên bề mặt ở môi trƣờng SSF.

4.4.2 Xác định nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men sinh tổng hợp protease từ A. niger ở thời gian tối ƣu (72 giờ)