3. NỘI DUN GỜ NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.5 Phương pháp Realtime PCR
Nguyên tắc
Là phản ứng chuỗi polyme phiên mã ngược dùng ựể phát hiện ARN của virus PRRS
Các bước tiến hành
a/ Chiết tách ARN của virus (theo hướng dẫn của nhà sản xuất)
Chúng tôi sử dụng kắt chiết tách Qiagen RNeasy minikit, các bước chiết tách ựược thực hiện như sau:
Bước 1:
Chuẩn bị dung môi RLT (600ộl/mẫu) vào ống ly tâm 50ml. Thêm 1/100 β-Mercaptoethanol (β-ME) vào dung môi RLT (dung môi này có thể bảo quản 1 tháng ở nhiệt ựộ phòng).
Bước 2: Tiến hành chiết tách
- Lắc mẫu trong 5 giây bằng máy vortex rồi ly tâm nhanh. - Cho 600 ộl dung môi RLT ựã bổ sung β-ME vào ống 1,5 ml. - Chuyển 200ộl mẫu sang ống 1,5 ml.
- Lắc ống 1,5 ml bằng máy vortex trong 15 giây và ly tâm nhanh . - Cho 400ộl cồn Ethanol 100% (cồn tuyệt ựối), và lắc (vortex) trong 15 giâỵ - Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt ựộ phòng
- đặt ống cột lọc (spin column) vào hệ thống hút chân không. - Chuyển hết dung dịch mẫu sang cột lọc và bật máy hút.
- Rửa lần 1: Cho 700ộl dung môi RW1 vào cột lọc và bật máy hút. - Rửa lần 2: Cho 500ộl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút. Cho tiếp 500ộl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút.
- đặt cột lọc vào ống thu mới (collection tube) - Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng/phút trong 2 phút
- Thu RNA : Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml mớị Cho 50 ộl nước không có RNase (RNase-free water) vào cột lọc, ủ 1 phút ở nhiệt ựộ phòng. Ly tâm 1 phút ở tốc ựộ >10.000 rpm.
- Chuyển mẫu RNA ựã thu sang ống 1,5ml mớị
- Cất giữ RNA : Có thể giữ RNA ở 40C trong vài giờ nếu sử dụng ngay
hoặc cất giữ ở nhiệt ựộ-200C nếu chưa dùng ngay trong ngàỵ
b/ Thực hiện phản ứng Realtime PCR
Tiến hành pha master mix
Master mix ựược chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất kắt. đối với Kắt Qiagen one-step RT-PCR và Kắt Invitrogen SS3 qRT-PCR, Master mix ựược chuẩn bị như sau:
Qiagen one-step RT-PCR kit Invitrogen SS3 qRT-PCR kit
Reagent Lượng (ộl) Reagent Lượng (ộl)
DW 10.5 DW 4.5
5x Reaction Mix 5.0 2x Reaction buffer 12.5
MgCl2 (25mM) 1.2 MgCl2 (50mM) 1.0
dNTP 0.8
PPP 1.5 PPP 1.5
Enzyme mix 1.0 Enzyme mix 0.5
Chú thắch: PPP-Primer và probe Sau khi chuẩn bị xong master mix:
- Cho 20ộl master mix vào ống PCR.
- Cho 5ộl mẫu RNA vào ống PCR.
- đặt ống PCR vào máy Realtime PCR machinẹ - Chạy chương trình.
- Chọn ựọc màu ở bước kéo dàị
Chạy phản ứng
Qiagen one-step RT-PCR Kit Invitrogen superscript 3 qRT-PCR kit RT PCR RT PCR 500C-30phút, 950C -15phút 40 chu kỳ x (950C - 10giây + 600C -50giây) 500C-15phút, 950C -2phút 40 chu kỳ x (950C - 10giây + 600C -50giây) đọc kết quả
Xét nghiệm ựược công nhận khi:
- đối chứng dương tắnh cho giá trị Ct ựã biết (ổ2), - đối chứng âm tắnh không có Ct
- Mẫu ựược coi là dương tắnh khi có Ct ≤ 35 - Mẫu ựược coi là âm tắnh nếu không có Ct - Mẫu ựược coi là nghi ngờ nếu Ct >35