3.3.2.1. Ảnh hưởng của cao Testin trên tình trạng chung và cân nặng chuột cống
Trong suốt quá trình nghiên cứu, chuột ở các lô đều ăn uống bình thường, ở các lô uống mẫu thử thì chuột ít vận động hơn. Ở lô uống cao Testin liều 12 g/kg cân nặng, một số chuột ỉa phân hơi đen (màu hơi giống cao thuốc đã cho uống, không phải là máu) và một số bị tiêu chảy nhẹ.
Khối lượng cơ thể chuột qua các thời điểm nghiên cứu (N0: trước khi cho uống mẫu thử, N14: sau khi cho uống mẫu thử 14 ngày, N28: sau khi cho uống mẫu thử 28 ngày) được thể hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15. Ảnh hưởng của cao Testin lên khối lượng cơ thể động vật thí nghiệm qua các thời điểm nghiên cứu
Nhận xét:
Trong suốt 28 ngày nghiên cứu, cân nặng chuột cống tăng đều ở các lô. Chuột lô uống cao Testin cả hai mức liều đều có xu hướng tăng chậm hơn lô chứng tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
3.3.2.2. Ảnh hưởng của cao Testin trên các chỉ số huyết học
Kết quả đánh giá các thông số huyết học (số lượng hồng cầu, hematocrit, hemoglobin, số lượng tiểu cầu, số lượng bạch cầu, bạch cầu đa nhân trung tính) tại
196.25 242.5 251.25 196.67 230.00 225.83 190.00 219.28 230.71 0 50 100 150 200 250 300 N0 N14 N28 Kh ố i lượn g cơ th ể ch u ộ t (g)
Thời điểm nghiên cứu
49
các thời điểm: trước khi cho uống mẫu thử (N0), sau khi cho uống mẫu thử 14 ngày (N14) và sau khi cho uống mẫu thử 28 ngày (N28) được trình bày tại bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của cao Testin đến các thông số huyết học Thông số đánh
giá Lô n
Thời điểm nghiên cứu
N0 N14 N28 Số lượng hồng cầu (G/L) Chứng 10 7,69±0,47 7,83±0,36 7,48±0,44 Thử 1 10 6,50±0,48 5,89±0,58** 6,61±0,56 Thử 2 10 6,02±0,57 5,47±0,26** 6,67±0,48 Hàm lượng hemoglobin (g/dL) Chứng 10 13,63±0,64 13,15±0,96 12,53±0,87 Thử 1 10 12,17±0,80 10,94±1,03 12,27±0,97 Thử 2 10 11,04±0,91 9,62±0,64* 11,97±0,83 Hematocrit (%) Chứng 10 38,89±2,16 38,66±1,64 34,01±2,60 Thử 1 10 35,04±2,36 29,59±3,11* 33,04±2,84 Thử 2 10 31,89±2,79 26,60±1,75** 32,86±2,51 Thể tích trung bình hồng cầu (fL) Chứng 10 50,71±0,57 49,46±0,75 47,94±0,46 Thử 1 10 54,37±2,63 50,20±1,23 50,00±1,14 Thử 2 10 52,89±2,82 48,45±1,13 49,13±0,52 Lượng Hb trung bình hồng cầu (pg) Chứng 10 17,83±0,31 16,85±1,05 17,75±0,33 Thử 1 10 18,89±0,72 18,73±0,64 18,67±0,58 Thử 2 10 18,43±0,62 17,52±0,45 18,00±0,26 Nồng độ Hb trung bình hồng cầu (g/dL) Chứng 10 35,17±0,46 36,59±0,47 36,99±0,44 Thử 1 10 34,84±0,72 37,24±0,63 37,33±0,58 Thử 2 10 35,05±0,67 36,15±0,18 36,65±0,39
Số lượng bạch cầu (T/L)
Chứng 10 15,57±1,65 17,61±1,80 16,68±2,39
Thử 1 10 13,63±1,48 13,43±0,62 15,49±1,93
Thử 2 10 19,78±2,15 14,98±1,24 15,71±1,28
Bạch cầu trung tính (%)
Chứng 10 95,64±0,66 82,61±5,50 91,36±2,80
Thử 1 10 92,43±4,07 77,91±5,76 90,83±3,02
Thử 2 10 95,45±0,56 68,78±10,25 89,34±4,65
Số lượng tiểu cầu (T/L)
Chứng 10 665,50±67,88 651,00±51,23 640,13±81,26
Thử 1 10 477,14±44,38 461,57±87,77 434,71±94,35 Thử 2 10 566,50±76,35 378,83±32,86** 653,80±131,67
(Số liệu biểu diễn dưới dạng M ± SE, *: p < 0,05 và **: p < 0,01 khi so sánh với chứng)
50
Nhận xét:
- Tại thời điểm trước khi cho chuột uống mẫu thử (N0), sau khi cho chuột uống mẫu thử 14 ngày (N14) và 28 ngày (N28) số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và bạch cầu đa nhân trung tính ở các lô uống cao Testin cả hai mức liều 6 g/kg và 12 g/kg cân nặng đều khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi so với lô chứng tại cùng thời điểm (p > 0,05). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Số lượng hồng cầu, tỷ lệ hematocrit giảm nhẹ so với lô chứng ở cả 2 lô chuột uống mẫu thử liều 1 và liều 2 tại thời điểm 14 ngày sau uống mẫu thử (p < 0,05). Tuy nhiên, đến ngày thứ 28 sau khi uống mẫu thử, các chỉ số này lại trở về bình thường (p > 0,05).
- Hàm lượng hemoglobin và số lượng tiểu cầu khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sau khi uống mẫu thử liều 1 ở các thời điểm lấy mẫu nhưng cả hai chỉ tiêu này ở lô chuột uống mẫu thử liều 2 đều giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng tại thời điểm 14 ngày sau uống mẫu thử. Song, sau khi uống mẫu thử 28 ngày cả hàm lượng hemoglobin và số lượng tiểu cầu cũng trở về bình thường (p > 0,05).
3.3.2.3. Ảnh hưởng của cao đặc Testin đến các chỉ số sinh hóa của chuột cống trắng
Kết quả định lượng hoạt độ ASAT, ALAT, định lượng cholesterol toàn phần, protein toàn phần và creatinin huyết thanh qua các thời điểm nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của cao Testin trên các chỉ số hóa sinh Chỉ số
đánh giá Lô n
Thời điểm nghiên cứu
N0 N14 N28 ASAT (U/L) Chứng 10 168,00±16,71 171,00±13,41 180,43±29,21 Thử 1 10 188,29±21,74 152,00±26,51 324,71±79,06 Thử 2 10 201,00±16,43 143,25±15,52 244,00±33,75 ALAT (U/L) Chứng 10 63,75±3,86 72,13±7,13 79,86±15,49 Thử 1 10 76,71±14,90 61,71±11,12 72,86±14,59
51 Thử 2 10 75,89±11,29 51,88±7,13 72,22±12,09 Cholesterol (mmol/L) Chứng 10 1,99±0,16 1,97±0,18 1,81±0,25 Thử 1 10 2,09±0,27 1,71±0,27 1,79±0,23 Thử 2 10 2,32±0,22 1,41±0,09* 1,88±0,14 Protein (g/L) Chứng 10 60,20±2,94 53,25±7,19 55,61±7,10 Thử 1 10 59,83±1,28 52,14±2,58 66,33±4,56 Thử 2 10 59,44±2,81 48,38±1,50 64,60±3,73 Creatinin (µmol/L) Chứng 10 42,50±2,69 52,25±2,61 43,25±3,80 Thử 1 10 40,99±3,52 50,57±2,51 39,63±4,31 Thử 2 10 44,89±3,66 43,38±2,65* 43,22±5,21
(Số liệu biểu diễn dưới dạng M ± SE, *: p < 0,05 khi so với lô chứng) Nhận xét:
- Tại các thời điểm trước khi uống mẫu thử, sau uống mẫu thử 14 và 28 ngày hoạt độ ASAT, ALAT và nồng độ protein toàn phần đều khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi so sánh giữa lô uống cao Testin liều 1 và liều 2 với lô chứng (p > 0,05).
- Đối với nồng độ cholesterol toàn phần và creatinin, tại các thời điểm trước uống mẫu thử, sau 14 và 28 ngày uống cao Testin liều 1 (6g/kg cân nặng), hai chỉ số này khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi so với lô chứng (p > 0,05). Tại thời điểm 14 ngày sau khi uống mẫu thử liều 2 (12 g/kg cân nặng) nồng độ cholesterol toàn phần và creatinin huyết thanh giảm so với lô chứng (p < 0,05). Nhưng tiếp tục cho chuột uống mẫu thử liều 2 đến ngày 28, hai thông số này lại trở về khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
3.3.2.4. Kết quả mô bệnh học
Sau 28 ngày cho uống mẫu thử liên tục, ở mỗi lô nghiên cứu lấy gan thận của 3 chuột để đánh giá vi thể. Tiêu bản vi thể gan, thận được thực hiện và đánh giá tại Bộ môn Giải phẫu bệnh- Trường Đại học Y Hà Nội.
Kết quả thu được như sau.
52
Cấu trúc thận ở trong giới hạn bình thường, không tăng sinh tế bào, không thấy hoại tử tế bào ống thận.
Tuy nhiên có các ổ xâm nhập viêm (chủ yếu lympho bào) và tăng sinh xơ (viêm thận kẽ mạn tính mức độ vừa và nhẹ).
Ảnh chụp được từ tiêu bản vi thể thận của các lô nghiên cứu là ảnh 3.1, ảnh 3.2, ảnh 3.3 dưới đây.
Ảnh 3.1. Cấu trúc vi thể thận lô chứng (HE x 100)
53
(a)
(b)
Ảnh 3.2. Cấu trúc vi thể thận lô thử liều 1
(a): Trong mô đệm có các ổ xâm nhập viêm mạn tính (mũi tên). HE x 100 (b) Ảnh phóng đại ổ xâm nhập viêm mạn tính (mũi tên). HE x 400.
54
(c)
(d)
Ảnh 3.3. Cấu trúc vi thể thận lô uống mẫu thử liều 2
(c): Trong mô đệm có nhiều ổ xâm nhập viêm mạn tính (mũi tên). HE x 100. (d) Ảnh phóng đại vùng xâm nhập viêm với nhiều lympho bào. HE x 400 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
55
b, Tiêu bản vi thể gan
Trên hình ảnh vi thể gan, cấu trúc gan không bị đảo lộn, vẫn nhận rõ các tiểu thùy với tĩnh mạch trung tâm và các bè gan xếp hình nan hoa bánh xe.
Tất cả vùng tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy và vùng gan khoảng cửa không xơ hóa, không có viêm xâm nhập, không tăng sinh ống mật.
Một số tế bào gan thoái hóa (chiếm khoảng 5- 15%) với các hình thái: thoái hóa nước, thoái hóa hạt, mất nhân, ít glycogen (ảnh 3.4.1, ảnh 3.4.2, ảnh 3.5.1, ảnh 3.5.2, ảnh 3.6.1, ảnh 3.6.2).
Tuy nhiên không có sự khác biệt về cấu trúc vi thể gan giữa lô dùng thuốc với lô chứng.
(e)
Ảnh 3.4.1. Cấu trúc vi thể gan lô chứng
(e): Cấu trúc gan không đảo lộn, không hoại tử tế bào gan, không thấy xâm nhập viêm và tăng sinh xơ. HE x 100
56
(f)
Ảnh 3.4.2. Cấu trúc vi thể gan lô chứng
(f): Một số tế bào gan thoái hóa nước, thoái hóa hạt (mũi tên đen). Một vài tế bào gan thoái hóa mất nhân (mũi tên xanh) HE x 400
(g)
Ảnh 3.5.1. Cấu trúc vi thể gan lô uống cao Testin liều 1
(g): Vùng có nhiều tế bào gan thoái hóa diện rộng, không hoại tử, không viêm. HE x 100
57
(h)
Ảnh 3.5.2. Cấu trúc vi thể gan lô uống cao Testin liều 1
(h): Vùng có tế bào gan thoái hóa (mũi tên), không hoại tử, không viêm. HE x 400
(i)
Ảnh 3.6.1. Cấu trúc vi thể gan lô uống cao Testin liều 2
(i): Vùng có tế bào gan thoái hóa (mũi tên), không hoại tử, không viêm. HE x 100
58
(k)
Ảnh 3.6.2. Cấu trúc vi thể gan lô uống cao Testin liều 2
(k): Vùng có tế bào gan thoái hóa (mũi tên), không hoại tử, không viêm. HE x 400
59
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Suy sinh dục nam là một hội chứng lâm sàng gây ra bởi sự thiếu hụt androgen. Hội chứng này có thể ảnh hưởng đến chức năng nhiều hệ cơ quan và chất lượng cuộc sống. Nội tiết tố androgen đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển và duy trì các chức năng sinh sản và tình dục nam giới. Nồng độ androgen trong máu thấp có thể gây ra rối loạn phát triển giới tính dẫn tới những bất thường bẩm sinh ở đường sinh dục nam. Hơn nữa, có thể gây giảm khả năng sinh sản, rối loạn chức năng tình dục, giảm hình thành cơ bắp và khoáng hóa xương, rối loạn chuyển hóa chất béo và rối loạn nhận thức. Nồng độ testosterone giảm có thể là hậu quả của quá trình lão hóa hoặc liên quan đến một số bệnh mạn tính. Sự thiếu hụt androgen tăng theo tuổi tác: sự suy giảm testosterone hàng năm là 0,4- 2,0%. Ở nam giới trung niên, tỉ lệ này là 6%. Sự thiếu hụt testosterone thường gặp hơn ở nam giới béo phì, có bệnh kèm theo hoặc tình trạng sức khỏe suy kiệt [44].
Liệu pháp điều trị suy sinh dục chủ yếu hiện nay là sử dụng testosteron thay thế. Liệu pháp này đã được chứng minh có nhiều lợi ích góp phần cải thiện các triệu chứng của bệnh như duy trì các đặc tính sinh dục thứ phát, cải thiện chức năng tình dục, tăng mật độ khoáng xương, cải thiện chức năng nhận thức [52], [56], [94], [95] . Ngoài việc sử dụng các testosteron có nguồn gốc sinh học hoặc tổng hợp, các chất có hoạt tính androgen có nguồn gốc thực vật cũng được khai thác trong hỗ trợ điều trị suy sinh dục nam.
Theo kinh nghiệm dân gian có khá nhiều bài thuốc, vị thuốc được sử dụng trong điều trị hoặc hỗ trợ điều trị suy sinh dục nam như Cá ngựa, Đỗ trọng, Nhục thung dung, Ba kích, Tọa dương, Thỏ ty tử, Bá bệnh…. [8], [17], [21]. Một số dược liệu trong số này cũng đã được chứng minh tác dụng tăng cường chức năng sinh sản nam bằng thực nghiệm như Bá bệnh, Xà sàng tử, Ba kích, Bạch tật lê… [11], [18], [36], [68], [76].
Xuất phát từ kinh nghiệm trong điều trị PGS.TS. Vũ Văn Điền, bộ môn Y học cổ truyền trường đại học Dược Hà Nội đã thiết kế bài thuốc Testin gồm các vị thuốc như sau:
60
Bá bệnh 14g
Bạch tật lê 14g
Xà sàng tử 12g Hoàng kỳ 16g Cốt khí củ 10g Câu kỷ tử 16g Đương quy 12g Ba kích 12g
Theo y học cổ truyền, trong bài thuốc có 4 vị thuốc là Bá bệnh, Xà sàng tử, Ba kích, và Bạch tật lê có tác dụng bổ dương, đã được sử dụng nhằm tăng cường chức năng sinh dục nam. Một số nghiên cứu cũng đã cho thấy các dược liệu này có tác dụng cải thiện sự suy giảm chức năng sinh sản, sinh dục nam [11], [18], [36], [68], [76]. Đồng thời trong công thức bào chế Testin có phối hợp thêm Hoàng kỳ, Đương quy, Câu kỷ tử để bổ khí huyết, bổ can thận, thêm Cốt khí củ làm tăng cường lưu thông máu và có tác dụng dược lý hướng sinh dục, tăng tác dụng bổ dương [21], [22], [23]. Sự kết hợp cả 8 vị như thế trong một bài thuốc với mong muốn vừa cải thiện chức năng sinh dục nam vừa bồi bổ cơ thể lẫn tăng cường lưu thông khí huyết thì tác dụng cải thiện sự suy giảm chức năng sinh sản, sinh dục sẽ tốt hơn.
Đề tài được tiến hành góp phần làm sáng tỏ tác dụng tăng cường chức năng sinh dục nam cũng như đánh giá khả năng gây độc (nếu có) của bài thuốc đối với cơ thể động vật. Đây là những cơ sở khoa học ban đầu nhằm từng bước đưa bài thuốc này vào áp dụng trên lâm sàng.
Nghiên cứu đã được thực hiện nhằm đánh giá hoạt tính androgen, tác dụng trên hành vi tình dục, độc tính cấp tính, độc tính bán trường diễn của bài thuốc.
Liều sử dụng trong nghiên cứu được tính ngoại suy từ liều dùng bài thuốc trên lâm sàng. Bài thuốc có tổng 106 g dược liệu chiết được 42 g cao đặc dùng trong một ngày cho người cân nặng khoảng 50 kg nên tính được liều cao dùng trên người là 0,84 g/kg/24h tương đương với liều trên chuột cống là 6 g/kg/24h (0,84 g/kg x 7) và liều trên chuột nhắt là 10 g/kg/24h (0,84 g/kg x 12).
61
4.1. Về hoạt tính androgen của cao đặc Testin
Để đánh giá hoạt tính androgen của mẫu thử chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trên 2 loại động vật là chuột cống đực non thiến và chuột cống đực trưởng thành.
Mô hình đánh giá hoạt tính androgen của thuốc dựa trên việc so sánh khối lượng tương đối các cơ quan sinh dục phụ đã được thực hiện từ những năm 1930. Đến năm 1953, Hershberger đã mô tả mô hình này với một số thay đổi và bổ sung [46]. Hiện nay, mô hình này được xem là mô hình thực nghiệm có giá trị nhất và được dùng phổ biến để chứng minh hoạt tính androgen của thuốc.
Các cơ quan nghiên cứu bao gồm túi tinh, tuyến tiền liệt, tuyến Cowper, cơ nâng hậu môn, quy đầu, tinh hoàn, đây là các cơ quan có sự phát triển phụ thuộc nhiều vào hoạt động của androgen. Khi khối lượng của hai hay trên hai cơ quan tăng lên có ý nghĩa thống kê so với lô chứng thì thuốc được coi là có hoạt tính androgen [74]. Theo OECD, nếu tiến hành đánh giá hoạt tính androgen trên nhóm đối tượng chuột nhắt đực thì có hai chỉ số không lấy được là tuyến tiền liệt và quy đầu do tuyến tiền liệt của chuột nhắt đực rất khó bóc tách một cách trọn vẹn vì tổ chức này quá mủn và nhỏ, nếu cố bóc tách sẽ cho sai số rất lớn về kết quả nghiên cứu. Quy đầu ở chuột nhắt không có mốc giải phẫu rõ ràng nên cũng cho sai số khá lớn khi tiến phân lập, bóc tách [74]. Từ những hạn chế đó, chúng tôi quyết định nghiên cứu trên nhóm đối tượng chuột cống trắng.
Trên chuột cống đực non, tiến hành thiến chuột nhằm loại bỏ tinh hoàn- cơ quan chính trong cơ thể sản xuất testosteron. Nói cách khác mô hình này loại bỏ được vai trò của testosteron nội sinh ngay từ khi các cơ quan sinh dục phụ chưa phát triển đầy đủ. Trong cơ thể, một trong những vai trò đặc biệt quan trọng của các androgen là tác dụng tăng sinh và phát triển cơ quan sinh dục nam trong đó bao gồm cơ nâng hậu môn, tuyến tiền liệt, túi tinh, tuyến Cowper… Vì vậy khi chuột chưa trưởng thành, nếu cắt bỏ tinh hoàn (thiến chuột) các cơ quan sinh dục phụ này sẽ rất nhỏ (do không phát triển được). Cụ thể, kết quả thí nghiệm thể hiện ở hình 3.1, 3.2 cho thấy khối lượng tương đối của các cơ quan sinh dục phụ ở chuột đực non thiến sau 17 ngày rất nhỏ so với chuột cống trưởng thành. Testin với mức liều 6 g/kg cân nặng không thể hiện hoạt tính androgen (không làm tăng khối lượng của
62
các cơ quan sinh dục phụ: tuyến tiền liệt, tuyến Cowper, túi tinh, cơ nâng hậu môn, quy đầu). Testin liều 12 g/kg làm tăng khối lượng cơ nâng hậu môn, tuyến tiền liệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05).
Tiến hành thí nghiệm trên chuột cống đực trưởng thành không thiến (giữ nguyên tinh hoàn), kết quả trình bày tại bảng 3.2 và hình 3.3, 3.4 cho thấy ở cả 2 mức liều 6 g/kg cân nặng và 12 g/kg cân nặng cao đặc Testin đều thể hiện hoạt tính androgen. Với mức liều 6 g/kg cân nặng, cao Testin làm tăng khối lượng tinh hoàn và cơ nâng hậu môn chuột thực nghiệm so với lô chứng (p < 0,05). Khi tăng liều lên gấp đôi (ở mức liều 12g/kg cân nặng) Testin làm tăng khối lượng túi tinh và cơ nâng hậu