2.1.1. Nguyên liệu:
Cao đặc bài thuốc Testin được bào chế tại bộ môn Dược học cổ truyền, trường ĐH Dược Hà Nội từ 8 vị dược liệu sau:
Bá bệnh 14g (Herba et Radix Eurycomae)
Bạch tật lê 14g (Fructus Tribuli Terrestris)
Xà sàng tử 12g (Frucrus Cnidii)
Hoàng kỳ 16g (Radix Astragali membranacei)
Cốt khí củ 10g (Radix Polygoni cuspidati)
Câu kỷ tử 16g (Fructus Lycii)
Đương quy 12g (Radix Angelicae sinensis)
Ba kích 12g (Radix Morindae officianlis)
Tổng: 106g
Các vị thuốc trên được mua tại nhà thuốc HARPHACO số 59 phố Lãn Ông- Hà Nội và được kiểm tra theo tiêu chuẩn DĐVN IV.
Sau khi kiểm tra đạt tiêu chuẩn, các vị thuốc được điều chế thành cao đặc theo phương pháp chiết nóng bằng cồn 40% 3 lần như mô tả ở phần phụ lục 1.
Cao đặc cũng được xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bao gồm các tiêu chuẩn sau: - Hình thức, cảm quan
- Hàm ẩm - Tro toàn phần
- pH của dung dịch cao thuốc pha loãng thành nồng độ 1% (Kg/TT) - Xác định chất chiết được bằng nước trong cao thuốc
- Định tính các nhóm chất hữu cơ theo thường quy hóa thực vật - Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
- Định tính dấu vân tay bằng HPLC - Định lượng flavonoid toàn phần
26
- Định lượng một số chất trong cao (osthole, imperatorin, piceid, 8- methoxypsoralen)
Tiêu chuẩn cụ thể của cao thuốc được trình bày ở phụ lục 2.
2.1.2. Đối tượng
+ Chuột cống đực non, khỏe mạnh, 35- 40 ngày tuổi, cân nặng 60- 70 g do Học viện Quân Y cung cấp.
+ Chuột cống đực và cái trưởng thành, 3 tháng tuổi, cân nặng 180- 220 g do Học viện Quân y cung cấp.
+ Chuột nhắt đực và cái trưởng thành, 8 tuần tuổi, cân nặng 18- 20 g do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.
Tất cả động vật nghiên cứu được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn, nước uống, độ thông khí và ánh sáng thích hợp tại khu nghiên cứu động vật thực nghiệm bộ môn Dược lực- trường Đại học Dược Hà Nội.
2.1.3. Thuốc và hóa chất
+ Testosteron propionat, thuốc tiêm (Sustanon 250 mg/ml, Organon, Netherlands).
+ Progesteron, thuốc tiêm (Progesteron BP 25 mg/ml, Rotexmedica, Germany).
+ Estrogen, thuốc tiêm (Ostradiolbenzoat 1500 mg/ml, Hanvet). + Thiopental 1g, bột pha tiêm (Rotexmedica, Germany).
+ Xylazin 20mg/ml, dung dịch thuốc tiêm (Kepro B.V., Hà Lan). + Amikacin 500 mg/2ml (Việt Nam) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Dung dịch Povidone iodine 10% (Công ty CPDP 3/2, Việt Nam) + Dung dịch NaCl 0,9% (Việt Nam)
+ Dung dịch bảo quản gan, thận (Formalin 40%)
2.1.4. Phương tiện và dụng cụ
+ Cân phân tích Shimazu AY 220 (D432712091), sai số 0,0001 g + Dụng cụ để pha dung dịch thuốc thử
+ Dụng cụ chăn nuôi chuột, cho chuột uống thuốc + Dụng cụ để tiến hành lấy máu, giải phẫu chuột
27
+ Webcam Logitech C270H, độ phân giải 3 megapixels + Máy tính lưu trữ video, phần mềm iSpy ghi hình
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Đánh giá hoạt tính androgen trên chuột cống đực trắng bằng phương pháp Hershberger Hershberger
2.2.1.1. Nguyên tắc:
Những chất có hoạt tính androgen có tác dụng làm tăng khối lượng của các cơ quan sinh dục phụ. Do đó, so sánh khối lượng tương đối các mô, cơ quan sinh dục phụ giữa lô chứng với lô thử giúp chứng minh hoạt tính androgen của mẫu thử [74].
2.2.1.2. Phương pháp
a. Trên chuột cống đực non thiến
Chuột cống đực non khoảng 35 ngày tuổi, khối lượng 60- 70 g sau khoảng 3 ngày nuôi trong điều kiện nghiên cứu mới, cắt bỏ hai bên tinh hoàn chuột, nuôi ổn định trong 7 ngày để hồi phục sức khỏe. Sau đó chuột được chia lô ngẫu nhiên, mỗi lô 6- 10 con và được dùng thuốc liên tục trong 10 ngày với liều lượng như sau:
- Lô 1: Uống dung môi pha mẫu thử (NaCMC 0,5%) (1 ml/100g cân nặng).
- Lô 2: Tiêm dưới da đùi dung dịch testosteron pha trong dầu oliu với liều 0,4 mg/kg cân nặng.
- Lô 3: Uống cao cồn 40% Testin liều 6 g/kg cân nặng (thể tích 1 ml/100g cân nặng).
- Lô 4: Uống cao cồn 40% Testin liều 12 g/kg cân nặng (thể tích 1 ml/100g cân nặng).
Đến ngày thứ 11, cân rồi mổ chuột. Các cơ quan sinh dục phụ được bóc tách và cân ngay trên cân phân tích, riêng túi tinh được ép nhẹ cho hết tinh dịch trước khi cân. Kết quả được tính theo khối lượng cơ quan mg/100g khối lượng cơ thể chuột, so sánh kết quả giữa các lô để đánh giá và rút ra kết luận. Phương pháp tiến hành được mô tả ở hình 2.1 dưới đây:
28
7 ngày sau thiến
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu hoạt tính androgen trên chuột cống đực non thiến
b. Trên chuột cống đực trưởng thành
Chuột cống đực trưởng thành 10- 12 tuần tuổi, khối lượng khoảng 200 g. Sau khi nuôi ổn định 5- 7 ngày trong điều kiện nghiên cứu, được chia thành 4 lô, mỗi lô 7- 10 con và cho uống mẫu thử trong vòng 10 ngày.
- Lô 1: Uống dung môi pha mẫu thử (NaCMC 0,5%) thể tích 1 ml/100g cân nặng
- Lô 2: Tiêm dưới da đùi dung dịch testosteron pha trong dầu oliu với liều 0,4 mg/kg cân nặng
- Lô 3: Uống cao cồn 40% Testin liều 6 g/kg cân nặng (thể tích 1 ml/100g cân nặng)
- Lô 4: Uống cao cồn 40% Testin liều 12 g/kg cân nặng (thể tích 1 ml/100g cân nặng)
Ngày thứ 11 cân lại khối lượng chuột, sau đó giết chuột bằng ether, mổ tách lấy các cơ quan sinh dục phụ gồm tinh hoàn, tuyến tiền liệt, túi tinh, tuyến Cowper, cơ nâng hậu môn, quy đầu rồi đem cân ngay các cơ quan này trên cân phân tích (túi tinh được ép nhẹ cho hết dịch trước khi cân). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quá trình nghiên cứu được tóm tắt ở hình 2.2 dưới đây:
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu hoạt tính androgen trên chuột cống đực trưởng thành
7 ngày nuôi ổn định
Chia lô Giết chuột, bóc tách,
cân các cơ quan sinh dục Cho uống mẫu thử 2 4 6 2 4 6 8 10 11 Ngày
Thiến chuột Chia lô Giết chuột, tách, cân các
cơ quan sinh dục Cho chuột
uống mẫu thử
2 4 6
2 4 6 8 10 11 Ngày y
29
2.2.1.3. Đánh giá kết quả
Các chỉ tiêu đánh giá:
- Khối lượng cơ thể chuột giữa các lô trước và sau khi dùng thuốc
- Khối lượng tương đối của các cơ quan sinh dục phụ (Tinh hoàn, qui đầu dương vật, cơ nâng hậu môn, tuyến tiền liệt, túi tinh, tuyến Cowper) được tính theo công thức:
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡ươ𝑛𝑔 đố𝑖 = 100 × 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐ơ 𝑞𝑢𝑎𝑛 sinh 𝑑ụ𝑐 𝑝ℎụ (𝑚𝑔 ℎ𝑜ặ𝑐 𝑔) 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐ơ 𝑡ℎể 𝑐ℎ𝑢ộ𝑡 (𝑔)
2.2.2. Đánh giá tác dụng của cao đặc Testin trên hành vi tình dục của chuột
2.2.2.1. Nguyên tắc:
Cho chuột đực đã có kinh nghiệm tình dục giao phối với chuột cái đang trong thời kỳ động dục. Ghi lại hành vi giao phối bằng camera. Quan sát và ghi lại các chỉ số hành vi tình dục. So sánh các kết quả thu được giữa các lô cho phép đánh giá tác dụng của thuốc thử trên hành vi tình dục [28].
2.2.2.2. Phương pháp
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Agmo [28].
Chuột cái được cắt bỏ buồng trứng 2 bên sau khi gây mê bằng thiopental và xylazin hydrochrorid. Sau khi nghỉ khoảng 10- 15 ngày, đưa chuột cái vào chu kì động dục nhân tạo bằng cách tiêm dưới da estradiol benzoat trước khi giao phối 52h, và progesteron trước khi giao phối 4h.
Chuột đực được làm quen với test hành vi tình dục trong 3 đợt huấn luyện, sau đó được thử 4 test sàng lọc, mỗi đợt cách nhau 4 ngày. Các test này được tiến hành vào pha tối của chu kì sinh học trong cùng phòng thí nghiệm. Trong quá trình ghép đôi, quan sát và ghi lại các chỉ số sau:
-ML (thời gian đạt đến tiếp cận- Mounting Latency): là khoảng thời gian từ khi con đực gặp con cái đến lần tiếp cận đầu tiên. Hành vi tiếp cận không đầy đủ (không có đẩy mạnh khung chậu) hoặc tiếp cận sai vị trí sẽ bỏ qua.
- IL (thời gian đạt đến xâm nhập- Intromission Latency): là khoảng thời gian từ khi con đực gặp con cái đến lần xâm nhập âm đạo đầu tiên.
30
- EL (thời gian đạt đến xuất tinh- Ejaculation Latency): là khoảng thời gian từ lần tiếp cận đầu tiên (hoặc xâm nhập âm đạo đầu tiên- nếu không có tiếp cận) đến lần xuất tinh đầu tiên.
-PEI (thời gian sau xuất tinh- Post Ejaculation Interval): là khoảng thời
gian từ sau khi xuất tinh lần đầu đến lần tiếp cận hoặc xâm nhập âm đạo tiếp theo (nếu không có tiếp cận) để bắt đầu một loạt giao cấu mới. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-MF (số lần tiếp cận- Mounting Frequency): là số lần con đực tiếp cận với con cái trong một loạt giao cấu.
-IF (số lần xâm nhập âm đạo- Intromission Frequency): là số lần dương vật con đực xâm nhập vào âm đạo con cái trong một loạt giao cấu.
Một vài thông số khác thường được tính toán:
- IR (tỷ lệ xâm nhập- Intromission Ratio, IR= IF/(MF+IF)): tham số này được tính bằng cách chia số lần xâm nhập cho tổng số lần tiếp cận và số lần xâm nhập.
-III (thời gian giữa các lần xâm nhập- Interintromission Interval, III=EL/IF): là khoảng thời gian giữa các lần xâm nhập dương vật vào âm
đạo chuột cái, tính bằng thời gian đạt đến xuất tinh chia cho số lần xâm nhập. - CR (tỷ lệ giao cấu- Copulatory Rate, CR=(MF+IF)/EL)
- Thử nghiệm kết thúc ghi được PEI hoặc khi ML, IL > 15 phút, EL > 30 phút, PEI > 15 phút. Những chuột xác định được chỉ số PEI được xem là đã hoàn thành test hành vi.
Các hành vi giao cấu của chuột đực được xác định như sau:
- Hành vi tiếp cận: thường được thực hiện vào thời điểm đầu của loạt giao cấu. Khi chuột đực bắt đầu gặp chuột cái, chuột đực sẽ tiếp cận với chuột cái từ phía sau, trèo lên lưng chuột cái và đẩy nhanh, nông khung chậu về phía chuột cái với tần số 17- 22 Hz trong vòng 300 ms, sau đó con đực từ từ rời khỏi lưng con cái và liếm cơ quan sinh dục. Hành vi này diễn ra trong 1 khoảng thời gian ngắn 5- 10 s. Một cơn được định nghĩa là 1 chuỗi các hành vi tiếp cận (thường từ 1- 5, trung bình là 2). Giữa mỗi cơn có một khoảng thời gian dài tạm dừng 20- 80 s, chuột đực có thể có các hành vi khác. Trước khi bắt đầu hoặc trong quá trình diễn ra hành vi tiếp cận, con cái có hành động ưỡn lưng- nếu không sẽ bị thay thế. Với chuột đực
31
chưa có kinh nghiệm, đôi khi cả ở chuột kinh nghiệm, có thể tiếp cận với định hướng không chính xác (lên đầu, hai bên sườn...). Những hành vi định hướng sai không được tính, nếu như không có lý do đặc biệt dẫn tới hành động đó.
-Hành vi xâm nhập âm đạo: trong quá trình tiếp cận, nếu con đực tìm thấy âm đạo của chuột cái (sau hành vi tiếp cận), nó sẽ bất ngờ đẩy khung chậu sâu hơn và đút dương vật vào âm đạo trong vòng 200- 300 ms. Sau đó, con đực ngừng đẩy khung chậu, rút nhanh, mạnh ra khỏi con cái và luôn luôn liếm dương
vật, con đực sẽ không bao giờ tiếp cận trở lại ngay sau khi xâm nhập. -Hành vi xuất tinh: sau vài lần xâm nhập vào âm đạo, con đực sẽ xuất
tinh. Xuất tinh được đặc trưng bởi sự đẩy khung chậu sâu và dài hơn (750- 2000 ms) và rời khỏi con cái chậm hơn. Sau khi xâm nhập âm đạo, con đực vẫn còn ở trên lưng con cái trong vòng 1- 3 s. Nhịp điệu co thắt bụng sau quan sát được rõ, sau đó chuột đực từ từ nâng chân trước mở ra. Sau khi xuất tinh, con cái rời khỏi con đực, con đực liếm bộ phận sinh dục của mình và không hoạt động trong khoảng 4- 7 phút. Có thể xác nhận hành vi xuất tinh qua sự kiểm tra tìm tinh dịch trong âm đạo con cái (nhẹ nhàng giãn âm đạo chuột cái bằng kẹp, sau đó cắm ống chiết xuất).
Kết thúc 4 test sàng lọc, chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô theo khả năng hoạt động tình dục (chỉ có những chuột hoạt động tình dục kém- tức là không hoàn thành ít nhất 1 trong 4 test sàng lọc mới được đưa vào nghiên cứu tiếp) và được dùng thuốc như sau:
- Lô 1: Uống NaCMC 0,5% với thể tích 1 ml/100 g cân nặng
- Lô 2: Uống cao cồn 40% Testin với liều 6 g/kg (thể tích 1 ml/100 g cân nặng)
- Lô 3: Uống cao cồn 40% Testin với liều 12 g/kg (thể tích 1 ml/100 g cân nặng) Chuột được ghép đôi với chuột cái trước khi dùng thuốc và sau khi dùng thuốc 7 ngày liên tiếp. Quan sát hành vi giao cấu, ghi lại các thông số và so sánh với lô chứng. Ngày cuối cùng, lấy máu chuột, ly tâm tách huyết thanh để định lượng testosteron ở khoa Sinh hóa Bệnh viện Phụ sản Trung ương. Khối lượng cơ thể chuột cũng được kiểm tra thường xuyên vào lúc bắt đầu thí nghiệm, trước và sau khi dùng thuốc để đánh giá tình trạng sức khỏe chung của chuột.
32
Các bước nghiên cứu được tiến hành theo hình 2.3 dưới đây.
0 4 18 23 28 33 38 43 48 53 59 Ngày
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu hành vi tình dục ở chuột cống
Ngày thứ 4 tiến hành cắt buồng trứng ở chuột cống cái.
2.2.2.3. Đánh giá kết quả
Các chỉ tiêu đánh giá gồm các chỉ số về hành vi giao cấu: ML, IL, EL, MF, IF, PEI, IR, III, CR, nồng độ testosteron huyết thanh.
2.2.3. Đánh giá độc tính của cao đặc Testin
2.2.3.1. Độc tính cấp
Xác định độc tính cấp của cao đặc Testin và LD50 (nếu có) theo phương pháp Litchfield- Wilcoxon [10], [25], [75]:
Chuột nhắt trắng khối lượng 18- 20 gam được chia thành 10 lô, mỗi lô 8 con. Trước khi uống thuốc 14 giờ, chuột không được cho ăn, nhưng vẫn uống nước bình thường. Sau đó chuột được dùng cao thuốc với các mức liều tương ứng dưới đây: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lô 1: Uống dung dịch NaCMC 0,5%
- Lô 2: Uống cao cồn 40% Testin với liều 28 g/kg
- Lô 3: Uống cao cồn 40% Testin với liều 32 g/kg
- Lô 4: Uống cao cồn 40% Testin với liều 34 g/kg
- Lô 5: Uống cao cồn 40% Testin với liều 35 g/kg
- Lô 6: Uống cao cồn 40% Testin với liều 36 g/kg
- Lô 7: Uống cao cồn 40% Testin với liều 48g/kg
Mẫu thử được pha trong NaCMC 0,5% để đảm bảo thể tích mẫu thử cho chuột uống là 2 ml/100 g thể trọng chuột. 2h sau khi uống liều 1, chuột được cho uống
1 2 3 4 5 6 7 8
Test huấn luyện và sàng lọc Bắt đầu dùng thuốc Đợt NC Test sau dùng thuốc 7 ngày. Lấy máu định lượng Testosteron
33
liều 2. Sau khi chuột nhận liều thử thứ hai 2h, chuột được cho ăn trở lại bình thường.
Theo dõi chuột liên tục trong vòng 4 giờ sau uống liều cuối, ghi lại số chuột chết trong 72 giờ và tình trạng chung của chuột trong 7 ngày sau khi uống thuốc (ăn uống, hoạt động, bài tiết....). Nếu chuột chết, mổ chuột để đánh giá đại thể tổn thương của các cơ quan. Xác định liều chết 50% (LD50) theo tỷ lệ chuột chết trong vòng 72 giờ đầu.
+ Chỉ tiêu đánh giá:
- Tình trạng chung của chuột: các hoạt động tự nhiên, tư thế, hành vi, màu sắc (da, lông, mắt, mũi, tai, đuôi, màng nhầy)...
- Số chuột chết trong vòng 72 giờ. - Xác định LD50 (nếu có).
- Nhận xét những biểu hiện bất thường của chuột (nếu có).
2.2.3.2. Độc tính bán trường diễn
+ Tiến hành trên chuột cống theo Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực của thuốc cổ truyền [10], [98]. Chuột được chia lô và cho uống như sau:
- Lô 1 (chứng): Uống NaCMC 0,5% thể tích 1 ml/100 g cân nặng
- Lô 2 (thử 1): Uống cao Testin với liều 6 g/kg (thể tích 1 ml/100g cân nặng)
- Lô 3 (thử 2): Uống cao đặc Testin với liều 12 g/kg (thể tích 1 ml/100g cân nặng)
+ Chuột được uống dung môi pha thuốc hoặc thuốc thử liên tục trong 28 ngày, mỗi ngày một lần.
+ Theo dõi tình trạng chung của chuột (tình trạng da, lông, mắt, sự tiết dịch, phân, nước tiểu, hoạt động tự nhiên, hành vi).
+ Chỉ tiêu đánh giá: Các thông số theo dõi được kiểm tra vào trước lúc uống thuốc (N0), sau 14 ngày (N14) uống thuốc , sau 28 ngày (N28) uống thuốc, bao gồm:
34
- Đánh giá chức năng tạo máu thông qua các chỉ số huyết học gồm số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu.
- Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng một số enzym và chất chuyển hoá trong máu: ALAT, ASAT, bilirubin toàn phần, protein và cholesterol