2.2.2.1. Nguyên tắc:
Cho chuột đực đã có kinh nghiệm tình dục giao phối với chuột cái đang trong thời kỳ động dục. Ghi lại hành vi giao phối bằng camera. Quan sát và ghi lại các chỉ số hành vi tình dục. So sánh các kết quả thu được giữa các lô cho phép đánh giá tác dụng của thuốc thử trên hành vi tình dục [28].
2.2.2.2. Phương pháp
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Agmo [28].
Chuột cái được cắt bỏ buồng trứng 2 bên sau khi gây mê bằng thiopental và xylazin hydrochrorid. Sau khi nghỉ khoảng 10- 15 ngày, đưa chuột cái vào chu kì động dục nhân tạo bằng cách tiêm dưới da estradiol benzoat trước khi giao phối 52h, và progesteron trước khi giao phối 4h.
Chuột đực được làm quen với test hành vi tình dục trong 3 đợt huấn luyện, sau đó được thử 4 test sàng lọc, mỗi đợt cách nhau 4 ngày. Các test này được tiến hành vào pha tối của chu kì sinh học trong cùng phòng thí nghiệm. Trong quá trình ghép đôi, quan sát và ghi lại các chỉ số sau:
-ML (thời gian đạt đến tiếp cận- Mounting Latency): là khoảng thời gian từ khi con đực gặp con cái đến lần tiếp cận đầu tiên. Hành vi tiếp cận không đầy đủ (không có đẩy mạnh khung chậu) hoặc tiếp cận sai vị trí sẽ bỏ qua.
- IL (thời gian đạt đến xâm nhập- Intromission Latency): là khoảng thời gian từ khi con đực gặp con cái đến lần xâm nhập âm đạo đầu tiên.
30
- EL (thời gian đạt đến xuất tinh- Ejaculation Latency): là khoảng thời gian từ lần tiếp cận đầu tiên (hoặc xâm nhập âm đạo đầu tiên- nếu không có tiếp cận) đến lần xuất tinh đầu tiên.
-PEI (thời gian sau xuất tinh- Post Ejaculation Interval): là khoảng thời
gian từ sau khi xuất tinh lần đầu đến lần tiếp cận hoặc xâm nhập âm đạo tiếp theo (nếu không có tiếp cận) để bắt đầu một loạt giao cấu mới.
-MF (số lần tiếp cận- Mounting Frequency): là số lần con đực tiếp cận với con cái trong một loạt giao cấu.
-IF (số lần xâm nhập âm đạo- Intromission Frequency): là số lần dương vật con đực xâm nhập vào âm đạo con cái trong một loạt giao cấu.
Một vài thông số khác thường được tính toán:
- IR (tỷ lệ xâm nhập- Intromission Ratio, IR= IF/(MF+IF)): tham số này được tính bằng cách chia số lần xâm nhập cho tổng số lần tiếp cận và số lần xâm nhập.
-III (thời gian giữa các lần xâm nhập- Interintromission Interval, III=EL/IF): là khoảng thời gian giữa các lần xâm nhập dương vật vào âm
đạo chuột cái, tính bằng thời gian đạt đến xuất tinh chia cho số lần xâm nhập. - CR (tỷ lệ giao cấu- Copulatory Rate, CR=(MF+IF)/EL)
- Thử nghiệm kết thúc ghi được PEI hoặc khi ML, IL > 15 phút, EL > 30 phút, PEI > 15 phút. Những chuột xác định được chỉ số PEI được xem là đã hoàn thành test hành vi.
Các hành vi giao cấu của chuột đực được xác định như sau:
- Hành vi tiếp cận: thường được thực hiện vào thời điểm đầu của loạt giao cấu. Khi chuột đực bắt đầu gặp chuột cái, chuột đực sẽ tiếp cận với chuột cái từ phía sau, trèo lên lưng chuột cái và đẩy nhanh, nông khung chậu về phía chuột cái với tần số 17- 22 Hz trong vòng 300 ms, sau đó con đực từ từ rời khỏi lưng con cái và liếm cơ quan sinh dục. Hành vi này diễn ra trong 1 khoảng thời gian ngắn 5- 10 s. Một cơn được định nghĩa là 1 chuỗi các hành vi tiếp cận (thường từ 1- 5, trung bình là 2). Giữa mỗi cơn có một khoảng thời gian dài tạm dừng 20- 80 s, chuột đực có thể có các hành vi khác. Trước khi bắt đầu hoặc trong quá trình diễn ra hành vi tiếp cận, con cái có hành động ưỡn lưng- nếu không sẽ bị thay thế. Với chuột đực
31
chưa có kinh nghiệm, đôi khi cả ở chuột kinh nghiệm, có thể tiếp cận với định hướng không chính xác (lên đầu, hai bên sườn...). Những hành vi định hướng sai không được tính, nếu như không có lý do đặc biệt dẫn tới hành động đó.
-Hành vi xâm nhập âm đạo: trong quá trình tiếp cận, nếu con đực tìm thấy âm đạo của chuột cái (sau hành vi tiếp cận), nó sẽ bất ngờ đẩy khung chậu sâu hơn và đút dương vật vào âm đạo trong vòng 200- 300 ms. Sau đó, con đực ngừng đẩy khung chậu, rút nhanh, mạnh ra khỏi con cái và luôn luôn liếm dương
vật, con đực sẽ không bao giờ tiếp cận trở lại ngay sau khi xâm nhập. -Hành vi xuất tinh: sau vài lần xâm nhập vào âm đạo, con đực sẽ xuất
tinh. Xuất tinh được đặc trưng bởi sự đẩy khung chậu sâu và dài hơn (750- 2000 ms) và rời khỏi con cái chậm hơn. Sau khi xâm nhập âm đạo, con đực vẫn còn ở trên lưng con cái trong vòng 1- 3 s. Nhịp điệu co thắt bụng sau quan sát được rõ, sau đó chuột đực từ từ nâng chân trước mở ra. Sau khi xuất tinh, con cái rời khỏi con đực, con đực liếm bộ phận sinh dục của mình và không hoạt động trong khoảng 4- 7 phút. Có thể xác nhận hành vi xuất tinh qua sự kiểm tra tìm tinh dịch trong âm đạo con cái (nhẹ nhàng giãn âm đạo chuột cái bằng kẹp, sau đó cắm ống chiết xuất).
Kết thúc 4 test sàng lọc, chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô theo khả năng hoạt động tình dục (chỉ có những chuột hoạt động tình dục kém- tức là không hoàn thành ít nhất 1 trong 4 test sàng lọc mới được đưa vào nghiên cứu tiếp) và được dùng thuốc như sau:
- Lô 1: Uống NaCMC 0,5% với thể tích 1 ml/100 g cân nặng
- Lô 2: Uống cao cồn 40% Testin với liều 6 g/kg (thể tích 1 ml/100 g cân nặng)
- Lô 3: Uống cao cồn 40% Testin với liều 12 g/kg (thể tích 1 ml/100 g cân nặng) Chuột được ghép đôi với chuột cái trước khi dùng thuốc và sau khi dùng thuốc 7 ngày liên tiếp. Quan sát hành vi giao cấu, ghi lại các thông số và so sánh với lô chứng. Ngày cuối cùng, lấy máu chuột, ly tâm tách huyết thanh để định lượng testosteron ở khoa Sinh hóa Bệnh viện Phụ sản Trung ương. Khối lượng cơ thể chuột cũng được kiểm tra thường xuyên vào lúc bắt đầu thí nghiệm, trước và sau khi dùng thuốc để đánh giá tình trạng sức khỏe chung của chuột.
32
Các bước nghiên cứu được tiến hành theo hình 2.3 dưới đây.
0 4 18 23 28 33 38 43 48 53 59 Ngày
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu hành vi tình dục ở chuột cống
Ngày thứ 4 tiến hành cắt buồng trứng ở chuột cống cái.
2.2.2.3. Đánh giá kết quả
Các chỉ tiêu đánh giá gồm các chỉ số về hành vi giao cấu: ML, IL, EL, MF, IF, PEI, IR, III, CR, nồng độ testosteron huyết thanh.