Khảo sát qui trình chiết tối ƣu của tinopal CBS-X bằng hai hệ dung môi chiết acetonitril và methanol có mặt axit photphoric (H3PO4). Xem xét sự ảnh huởng của nồng độ axit photphoric (H3PO4) đến hiệu suất thu hồi của quá trình chiết.
Bảng 3.1: Ảnh huởng của nồng độ axit photphoric (H3PO4) đến hiệu suất thu hồi của quá trình chiết.
Dung môi chiết Nồng độ H3PO4 (%)
0,0 1,0 2,0 3,0 3,5 4,0 MeOH 0,00 0,77 1,88 18,04 24,19 41,47 ACN 0,00 0,08 14,31 28.22 41,71 73,91 v = 1,2 ml/phút v = 1,0 ml/phút v = 0,8 ml/phút v = 0,5 ml/phút
Hình 3.5: Giản đồ biểu thị hiệu suất chiết tinopal CBS-X bằng MeOH và ACN.
(a) (b)
Hình 3.6: Khảo sát hai qui trình chiết tối ƣu của tinopal CBS-X. (a) methanol có mặt axit photphoric (H3PO4), (b) acetonitril có mặt axit photphoric (H3PO4).
Nhận xét: Dựa vào giản đồ cho ta thấy: Hiệu suất thu hồi tăng theo nồng độ axit có trong dung môi, điều này là do dạng chiết của tinopal CBS-X vào pha hữu cơ là dạng axit. Hiệu suất thu hồi bằng dung môi acetonitril có mặt axit photphoric tốt hơn dung môi methanol có mặt axit photphoric.
Từ các kết quả khảo sát các thông số điều kiện của dung môi chiết thông qua điều kiện phân tích trên HPLC - RF, hiệu suất thu hồi quá trình chiết mẫu ta có đƣợc:
- Điều kiện phân tích trên HPLC - RF:
+ Cột phân tích: Ecosil C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) hoặc loại tƣơng đƣơng.
+ Pha động: MeOH: H2O.
Bảng 3.2: Chƣơng trình theo tỷ lệ Gradient dung môi.
T (phút) 0,01 5 7 15 17 20 30
MeOH (%) 50 50 90 90 50 50 50
H2O (%) 50 50 10 10 50 50 50
+ Nhiệt độ buồng cột 40 0C.
+ Đầu dò huỳnh quang: ở λex = 350 nm và λem = 430 nm. + Thể tích bơm mẫu: 10 µL.
+ Tốc độ dòng pha động: 1,0 mL/phút.
- Qui trình tối ƣu chiết tinopal CBS – X trong nền mẫu tinh bột gạo: Cân 5,00 g mẫu đã đồng nhất ở trên bằng cân phân tích vào ống ly tâm dung tích 50 ml. Thêm 10 ml acetonitril có mặt 4% H3PO4, lắc đều trong 2 - 3 phút bằng máy lắc xoáy (vortex), tiếp theo siêu âm trong 20 phút. Sau đó ly tâm ở tốc độ 5000 vòng / phút trong 5 phút. Gạn lấy dịch trong vào bình định mức 25 ml. Tiếp tục chiết lặp lại lần 2 với 10 ml acetonitril có mặt 4% H3PO4. Gộp dịch chiết và định mức đến 25 ml bằng acetonitril có mặt 4% H3PO4. Lọc dịch
chiết qua màng lọc 0,45 µm rồi chuyển vào lọ mẫu và tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Với các điều kiện khảo sát trên thiết bị và qui trình chiết tách mẫu ra khỏi nền mẫu bột gạo đã phù hợp cho một phƣơng pháp phân tích. Tiến hành đánh giá phƣơng pháp phân tích tinopal CBS-X trên nền mẫu bột gạo.
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
Qua các kết quả khảo sát trên ta tiến hành xây dựng khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn, phân tích mẫu để đánh giá phƣơng pháp phân tích.
3.3.1. Khoảng tuyến tính
Xây dựng khoảng tuyến tính gồm các điểm chuẩn 1,0 µg/L; 10,0 µg/L; 50,0 µg/L; 100,0 µg/L; 500,0 µg/L.
Bảng 3.3: Khoảng tuyến tính của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang.
STT 1 2 3 4 5
Nồng độ (µg/L) 1,0 10,0 50,0 100,0 500,0
Diện tích 209878 1462753 7041749 13284177 50013568
Hình 3.8: Sắc ký đồ khoảng tuyến tính của tinopal CBS-X
Xây dựng đƣờng chuẩn gồm các điểm chuẩn nằm trong khoảng tuyến tính 1,0 µg/L; 10,0 µg/L; 20,0 µg/L; 50,0 µg/L; 70,0 µg/L; 100 µg/L.
Bảng 3.4: Đƣờng chuẩn của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang.
STT 1 2 3 4 5 6
Nồng độ (µg/L) 1,0 10,0 20,0 50,0 70,0 100,0
Diện tích 199528 1824153 3342337 8628027 11650719 17265261
Hình 3.10: Sắc ký đồ các mẫu chuẩn tinopal CBS-X.
Nhận xét: Đƣờng chuẩn của tinopal CBS-X có phƣơng trình tuyến tính bậc nhất y = 170751x + 8607,1 và hệ số tƣơng quan r2 = 0,9993.
Bảng 3.5: Độ lặp lại tại nồng độ 20 µg/L, 50 µg/L chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang.
STT 1 2 3 4 5 6 Trung bình (µg/L) Độ lặp lại %RSD Nồng độ 20 µg/L 18,9 19,0 19,0 19,1 19,1 18,8 19,00 0,67 Nồng độ 50 µg/L 48,9 49,2 48,7 49,0 49,0 49,3 49,02 0,46 Nhận xét: Độ lệch chuẩn tƣơng đối của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang nhỏ hơn 2% thỏa mãn yêu cầu phép phân tích.