2.3.4.1. Nguyên tắc:
- Nhuộm hóa mô miễn dịch được thực hiện trên các lát cắt mô vùi nến bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch men Biotin – Avidin Complex (ABC) theo quy trình hướng dẫn nhuộm của hãng DAKO, 2003.
2.3.4.2. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
- Vật liệu kháng nguyên có mặt trong một mô phản ứng đặc hiệu với một kháng thể chống lại nó. Phản ứng miễn dịch này gây lắng đọng kháng thể đặc hiệu trên vùng mô có kháng nguyên, kháng thể này được gắn với peroxydase.
- Trong kỹ thuật miễn dịch men ABC, ái lực cao giữa avidin với biotin được sử dụng để ghép cặp peroxidase đánh dấu với kháng thể thứ nhất. Để làm tăng độ nhạy của kỹ thuật, tiến hành bộc lộ vị trí quyết định kháng nguyên, bước này được gọi là “ bộc lộ kháng nguyên” hoặc “ phục hồi kháng nguyên”. Kỹ thuật này có thể làm tiêu nhiều loại enzim tiêu protein, xử lý bằng cách cho tiếp xúc với tác động kết hợp của nhiệt và áp suất trong một nồi áp suất.
Trong quá trình làm kỹ thuật phải loại trừ các trường hợp dương tính giả, đó là do hoạt động của peroxydase nội sinh và nhuộm nền. Để loại bỏ các yếu tố này, có hai điều quan trọng là khử hoạt động của peroxydase nội sinh bằng hydrogen peoxide và pha loãng kháng thể ở nồng độ loãng tối ưu nhất. Tiến hành các kỹ thuật một cách tỷ mỉ, kiểm tra thường xuyên hoạt động kháng thể, chứng âm, chứng dương. Trong nghiên cứu này, chất tạo hợp chất màu là diaminobenzidine(DAB).
* Quy trình kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch
Chúng tôi tiến hành phương pháp hoá mô miễn dịch sử dụng các kháng thể đơn dòng kháng các kháng nguyên đặc hiệu: ER , PR , Her-2/neu, áp dụng cho các mảnh cắt mô đã chuyển đúc trong paraffin. Toàn bộ quy trình được thể hiện ở hình 2.2:
Hình 2.2 Sơ đồ mô tả qui trinh nhuộm hóa mô miễn dịch
Mẫu nến lưu trữ được cắt thành các lát mỏng có độ dày 3 µm và lên tiêu bản. Ủ tiêu bản trong tủ ấm qua đêm ở nhiệt độ 39-400C và loại parafin bằng xyleme và ethanol (hình 2.1). Nhúng tiêu bản qua bể nước cất 2 lần. Do protein đã bị biến đổi
trong quá trình xử lý mẫu, nên cần được bộc lộ lại bằng cách đặt tiêu bản trong dung dịch đệm citrate pH = 6, đun cách thuỷ trong nồi đun bộc lộ kháng nguyên trong 15 phút ở nhiệt độ 90-950C.Để nguội tại nhiệt độ phòng rồi rửa nước cất 2 lần trong 5 phút. Đánh dấu vị trí mô bằng bút mỡ. Khử men peroxydase nội sinh bằng dung dịch H2O2 3% x 10 phút và đặt trong bóng tối. Tiếp tục rửa tiêu bản qua ba bể chứa dung dịch TBS, pH 7,6 (3 phút/bể). Phủ kháng thể thứ nhất dành cho mô vú (ER, PR, Her2/neu) trong 60 phút. Sau đó rửa tiêu bản qua ba bể chứa dung dịch TBS (3 phút/bể). Phủ kháng thể thứ hai (Byotinylated Secondary Antibod) trong 30 phút, tiêu bản được rửa như trên. Phủ dung dịch chỉ thị màu 3,3’Diaminobenzidine (DAB) trong 10 phút, sau đó rửa dưới nước vòi chảy trong 5 phút. Cuối cùng, nhuộm màu nhân bằng hematoxyline trong 30 giây. Khử nước, làm sạch tiêu bản, gắn lá kính bằng Baume Canada, đọc kết quả trên kính hiển vi quang học.
2.3.4.3. Cách đánh giá kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch
* Đánh giá ER, PR theo thang điểm Allred
- Số lượng tế bào (TB) bắt màu % TB bắt
màu (PS) 0 <1/100 1/100 -1/10 1/10-1/3 1/3-2/3 >2/3
Điểm 0 1 2 3 4 5
- Cường độ tế bào bắt màu
Cường độ
bắt màu (IS) Không bắt màu Bắt màu yếu trung bình Bắt màu Bắt màu mạnh
Điểm 0 1 2 3
Hình 2.3 Thang điểm đánh giá ER, PR theo Alldred
Tổng điểm = PS + IS.
Dương tính khi tổng điểm > 0. 0: 0 điểm. 1+: 2-4 điểm 2+: 5-6 điểm 3+: 7-8 điểm.
* Cách đánh giá thụ thể Her -2 trên tiêu bản HMMD
Đối với Her2: Đánh giá theo tiêu chuẩn của Dako, có sự đối chiếu với các hình ảnh mẫu sau:
Hình 2.4 Đánh giá Her-2/neu theo tiêu chuẩn Dako
(Nguồn Dako, HercepTestTM Interpretation Manual - Breast Cancer[37])
0 : Hoàn toàn không bắt màu
1+: Không nhìn thấy hoặc nhuộm màng bào tương dưới 10% tế bào u 2+: Màng bào tương bắt màu từ yếu đến trung bình trên 10% tế bào u. 3+: Màng bào tương bắt màu toàn bộ với cường độ mạnh được quan sát thấy trên 10% các tế bào u
Chỉ 2+ và 3+ mới được coi là dương tính [8], [37].
2.3.2.3. Một số lưu ý khi áp dụng kĩ thuật hóa mô miễn dịch
Kĩ thuật: Cố định mô hoặc bệnh phẩm đúng cách trong formalin 10% là một điều rất cần thiết với chất lượng của sản phẩm HMMD. Việc cố định quá vẫn tốt
0 1+
3+ 2+
hơn là việc chưa cố định đủ thời gian bởi với các kỹ thuật hiện đại thì chúng vẫn được bộc lộ kháng nguyên hơn so với cố định chưa đủ. Cách tốt nhất khi dùng hệ thống phát hiện dựa trên chuỗi polimer là những tiến bộ đạt trong kỹ thuật khử Avidin- Biotin do đó tránh được những phản ứng không đúng với biotin nội sinh.
Tiến bộ trong bộc lộ kháng nguyên nên áp dụng đối với từng loại kháng thể. Mỗi loại kháng thể khác nhau đòi hỏi một cách bộc lộ kháng nguyên một cách nhất định trong khi đó một số kháng thể lại không đòi hỏi gì.
Lựa chọn kháng thể: Ban đầu lựa chọn kháng thể theo danh mục chung sau đó theo sơ đồ để lựa chọn kháng thể đặc hiệu với từng khối u. Tránh dùng một kháng thể đơn độc (sẽ dẫn đến kết quả chẩn đoán nhầm) và luôn luôn dùng ít nhất hai kháng thể cho một kháng nguyên đặc hiệu đích.
Việc lựa cho panel kháng thể cho kháng nguyên đặc hiệu đích được cân nhắc dựa trên bối cảnh hình thái học và các biểu hiện lâm sàng của bất kì loại u nào. Không dùng “buckshot” để tạo phản ứng sẽ dương tính.
Không sắp xếp trước kháng thể trước khi quan sát hình thái học. HMMD chỉ là phương tiện trợ giúp thêm về mặt chất lượng cho giải phẫu bệnh và ngược lại hình thái học cũng bổ sung thêm cho HMMD.
Đọc: Đọc HMMD phải đặt trong bối cảnh vị trí và sự phân bố của kháng nguyên đích trong tế bào. Ví dụ ở màng tế bào, bào tương, nhân, bộ Golghi…
Chứng: Điều quan trọng nhất là phải có chứng dương tính và âm tính với mô thích hợp, đảm bảo rằng các phản ứng đều được thực hiện đúng. Đây là yếu tố quan trọng đảm bảo chất lượng của phản ứng HMMD và chứng cần được thực hiện hằng ngày để tránh hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả. Phản ứng HMMD được thực hiện mà không có chứng thích hợp thì vô giá trị thậm chí rất nguy hiểm bởi nó ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả chẩn đoán mô từ đó quyết định đến thái độ điều trị.
