liệu Ý dĩ, Bồ Đề, Xấu hổ và Lâm vồ
3.2.1. Ảnh hưởng của các dược liệu đến thể tích nước tiểu
Xác định thể tích nƣớc tiểu 5 giờ của từng lô. So sánh thể tích nƣớc tiểu 5 giờ của các lô uống chế phẩm thử với lô chứng bệnh và lô chứng dƣơng để đánh giá ảnh hƣởng của từng dƣợc liệu đến thể tích nƣớc tiểu chuột thí nghiệm.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của các dược liệu đến thể tích nước tiểu (ml)
Lô Liều (g/kg) n Thể tích nƣớc tiểu (ml)
Chứng bệnh - 8 3,3 ± 0,4 Chứng dƣơng 2,5 9 8,4 ± 0,4** Ý dĩ 2,52 8 3,2 ± 0,5## Bồ đề 2,52 9 2,5 ± 0,4## Xấu hổ 2,52 9 3,9 ± 0,3## Lâm vồ 2,52 9 2,9 ± 0,4## ** p < 0,01 so với chứng bệnh ## p < 0,01 so với lô chứng dƣơng
Nhận xét: Khi so sánh với lô chứng bệnh, thể tích nƣớc tiểu ở lô chứng dƣơng cao hơn có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó, thể tích nƣớc tiểu ở các lô uống cao lỏng Ý dĩ, Bồ đề, Xấu hổ và Lâm vồ không có sự khác biệt so với ô chứng bệnh.
3.2.2. Ảnh hưởng của các dược liệu đến pH nước tiểu
Sau khi xác định thể tích nƣớc tiểu 5 giờ của chuột, tiến hành đo pH nƣớc tiểu chuột của từng lô.
Hình 3.7: Ảnh hưởng của từng loại dược liệu đến pH nước tiểu chuột Nhận xét: pH nƣớc tiểu ở các lô thuốc thử và lô chứng dƣơng không có sự khác biệt đáng kể so với lô chứng bệnh (p > 0,05).
3.2.3. Ảnh hưởng của các dược liệu đến số lượng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu
Quan sát tinh thể niệu dƣới kính hiển vi quang học, đánh giá số lƣợng và kích thƣớc các tinh thể CaOx (bao gồm các tinh thể COM và COD).
Về số lượng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu:
Sau khi đếm số lƣợng tinh thể CaOx bằng kính hiển vi quang học ở độ phóng đại x400 và cho điểm theo bảng 2.1.
Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.6:
6,94 7,12 7,07 7,45 7,07 7,51 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Chứng bệnh (n=8) Chứng dƣơng (n=9) Ý dĩ (n=8) Bồ đề (n=9) Xấu hổ (n=9) Lâm vồ (n=9) pH nƣ ớc t iểu
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của các dƣợc liệu đến số lƣợng tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu
Lô Liều (g/kg) n Điểm đánh giá số lƣợng tinh thể niệu (tứ phân vị) Chứng bệnh - 8 3 (3 – 3) Chứng dƣơng 2,5 9 0 (0 – 0)** Ý dĩ 2,52 8 3 (2 – 3)## Bồ đề 2,52 9 3 (3 – 3) ## Xấu hổ 2,52 9 3 (3 – 3) ## Lâm vồ 2,52 9 3 (3 – 3) ## ** p < 0,01 khi so sánh với chứng bệnh ##
p < 0,01 khi so với lô chứng dƣơng
Nhận xét: Số lƣợng tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu ở lô chứng dƣơng thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh. Ở các lô thuốc thử thì không có sự khác biệt về số lƣợng tinh thể CaOx trong nƣớc tiểu so với lô chứng bệnh.
Về hình ảnh tinh thể niệu:
Hình ảnh tinh thể calci oxalat của các lô đƣợc trình bày trong các hình 3.8.
Nhận xét: Hình ảnh tinh thể niệu cho thấy, tinh thể calci oxalat có mặt ở cả các lô chứng bệnh, Ý dĩ, Bồ đề, Xấu hổ và Lâm vồ. Ở lô chứng bệnh, các tinh thể có kích thƣớc lớn, số lƣợng tinh thể COM nhiều hơn số lƣợng tinh thể COD. Trong khi đó, khi quan sát lô chứng dƣơng thấy số lƣợng tinh thể calci oxalat là rất ít, kích thƣớc rất nhỏ và chủ yếu tồn lại ở dạng COD, tỷ lệ COD/COM có xu hƣớng tăng lên. Tỷ lệ này cũng có xu hƣớng tăng lên ở lô Ý dĩ và lô Bồ đề. Ở 2 dƣợc liệu Xấu hổ và Lâm vồ, kích thƣớc các tinh thể lớn, tỷ lệ COD/COM có xu hƣớng giảm xuống hoặc giữ nguyên.
Chứng bệnh Chứng dƣơng Ý dĩ
Bồ đề Xấu hổ Lâm vồ
Hình 3.8: Hình ảnh tinh thể calci oxalat trong nước tiểu của 6 lô chuột ở độ phóng đại x400
A: Lô chứng bệnh D: Lô Bồ đề
B: Lô chứng dƣơng E: Lô Xấu hổ
C: Lô Ý dĩ F: Lô Lâm vồ
COM COD COD COM COM COM COM COD COD COD COD COM
3.2.4. Tác dụng ức chế sự lắng đọng tinh thể calci oxalat trong thận trên mô hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol 0,75% hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol 0,75%
Về số lượng ống thận lắng đọng tinh thể calci oxalat:
Sau khi xác định số lƣợng ống thận xuất hiện lắng đọng các tinh thể. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.7:
Bảng 3.7: Điểm phản ánh mức độ kết tập sỏi tại thận
Lô Liều (g/kg) n Điểm phản ánh mức độ lắng đọng tinh thể calci oxalat tại thận
Chứng bệnh - 8 8,0 (2,2 – 9,6) Chứng dƣơng 2,5 9 0,4 (0,2 – 0,7)* Ý dĩ 2,52 8 0,2 (0,0 – 1,0) Bồ đề 2,52 9 4,0 (0,0 – 10,0) # Xấu hổ 2,52 9 2,8 (1,0 – 10,0)# Lâm vồ 2,52 9 5,5 (1,0 – 9,9) # * p < 0,05 khi so sánh với chứng bệnh #
p < 0,05 so với lô chứng dƣơng
Nhận xét: Số lƣợng ống thận có kết tập sỏi ở lô chứng dƣơng thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh.
Số lƣợng ống thận có kết tập sỏi ở lô Ý dĩ thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh và không có sự khác biệt đáng kể khi so với lô chứng dƣơng.
Trong khi đó, các lô uống cao lỏng Bồ đề, Xấu hổ và Lâm vồ không có sự khác biệt so với lô chứng bệnh về số lƣợng ống thận có kết tập sỏi.
Về hình ảnh mô bệnh học thận dưới kính hiển vi quang học phân cực:
Hình ảnh vi thể thận của các chuột đại diện cho từng lô đƣợc trình bày trong các hình 3.9, 3.10.
Chứng bệnh Chứng dƣơng Ý dĩ
Bồ đề Xấu hổ Lâm vồ
Chứng bệnh Chứng dƣơng Ý dĩ
Bồ đề Xấu hổ Lâm vồ
Nhận xét: Trên hình ảnh vi thể thận, tinh thể CaOx ở lô chứng bệnh lắng đọng rất nhiều, kết tụ lại thành các đám sỏi lớn, nằm rải rác trong thận.
Ở lô chứng dƣơng và Ý dĩ hầu nhƣ không có tinh thể lắng đọng ở các ống thận. Trong khi đó, ở các lô uống cao lỏng Bồ đề, Xấu hổ và Lâm vồ, các tinh thể lắng đọng tại nhiều vị trí khác nhau trong thận, các đám sỏi kết tập lại thành các đám lớn nhỏ và nằm rải rác trong thận.
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1. Bàn luận về việc hiệu chỉnh mô hình gây sỏi tiết niệu trên thực nghiệm bằng EG 0,75%. EG 0,75%.
4.1.1. Về những thay đổi trong mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về mô hình gây sỏi tiết niệu thực nghiệm, tuy nhiên, chƣa có sự thống nhất giữa các tác giả. Các mô hình gây sỏi tiết niệu rất khác nhau cả về hóa chất, liều lƣợng, thời gian…. Sự khác nhau này có thể do chế độ ăn uống, điều kiện nuôi dƣỡng hoặc mục đích nghiên cứu. Ở Việt Nam, cho đến nay, mới có một đề tài: “Triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu trên động vật thí nghiệm” của tác giả Phạm Đức Vịnh về mô hình gây sỏi tiết niệu thực nghiệm và đã thu đƣợc kết quả bƣớc đầu. Tuy nhiên, mô hình gây sỏi tác giả Phạm Đức Vịnh đã triển khai vẫn còn một số hạn chế [15].
Về hóa chất gây sỏi:
Mặc dù việc bổ sung AC làm tăng kết tập sỏi trong thận, đồng thời, AC làm giảm pH nƣớc tiểu; pH nƣớc tiểu giảm cũng là yếu tố nguy cơ gây sỏi tiết niệu. Tuy nhiên, do một số hạn chế khi sử dụng AC kết hợp trong nghiên cứu triển khai nên chúng tôi loại bỏ AC trong thành phần hóa chất gây sỏi.
Trƣớc hết, độc tính của mô hình EG kết hợp amoni clorid (AC) thể hiện rõ trên động vật thí nghiệm trong khi không có biểu hiện bất thƣờng nào đƣợc ghi nhận khi sử dụng mô hình EG đơn độc. Độc tính của mô hình EG + AC thể hiện ở thể trạng chuột và tỷ lệ chuột chết trong quá trình thí nghiệm. Thể trạng chuột bị ảnh hƣởng lớn nhƣ chuột chậm lớn hơn, chuột có dấu hiệu giảm ăn, uống. Tỷ lệ chuột chết trong quá trình nghiên cứu là 33% (3/9 chuột chết trong quá trình thí nghiệm). Thể trạng chuột xấu đi cũng nhƣ tỷ lệ chuột chết cao cũng đƣợc ghi nhận trong nghiên cứu của Fan và các cộng sự về mô hình gây sỏi tiết niệu trên thực nghiệm khi nồng độ AC > 0,5% [31]. Hơn nữa, độc tính của mô hình triển khai có thể do AC có khả năng gây suy ống thận. Hạn chế khác của việc bổ sung AC là kết quả chứng dƣơng natri citrat không thể hiện đƣợc tác dụng. Việc sử dụng chứng dƣơng natri citrat để đánh giá tác dụng trên mô hình EG kết hợp với AC
chƣa đƣợc chứng minh và khẳng định. Một chất đƣợc gọi là chứng dƣơng cho một mô hình khi nó là một thuốc tân dƣợc, có cơ chế tác dụng và hiệu quả rõ ràng, đã đƣợc chứng minh hoặc đƣợc thừa nhận rộng rãi [34], [36]. Citrat đã đƣợc một số tác giả sử dụng để làm chứng dƣơng trong các nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi thận của một số dƣợc liệu trên mô hình EG đơn độc [45], [65]. Nhƣng chƣa có tác giả nào sử dụng citrat làm chứng dƣơng để đánh giá tác dụng trên mô hình EG + AC. Hơn nữa, sự bài tiết của citrat phụ thuộc vào cân bằng acid – basơ trong nƣớc tiểu. Việc sử dụng AC làm giảm pH nƣớc tiểu, điều này có thể ảnh hƣởng đến tác dụng của citrat: pH nƣớc tiểu giảm, dẫn đến sự tái hấp thu citrat trong ống thận tăng, làm giảm nồng độ citrat trong nƣớc tiểu, do đó làm giảm tác dụng của citrat [31]. Mặt khác, AC có vị đắng làm cho chuột có thể giảm uống nƣớc, làm giảm lƣợng EG đƣợc đƣa vào cơ thể chuột, do đó ảnh hƣởng đến sự quá bão hòa oxalat trong nƣớc tiểu chuột và ảnh hƣởng đến quá trình hình thành sỏi tiết niệu.
Nhƣ vậy, nghiên cứu của chúng tôi chỉ sử dụng EG đơn độc để gây sỏi trên chuột cống trắng.
Về nồng độ chất gây sỏi:
Trong hầu hết các nghiên cứu đƣợc công bố cũng nhƣ trong nghiên cứu triển khai của tác giả Phạm Đức Vịnh, nồng độ EG đƣợc sử dụng dao động trong khoảng từ 0,5% đến 1%. Kết quả thu đƣợc cũng rất dao động, tỷ lệ chuột có sỏi từ 0% đến 71,4% [27], [40], [43]. Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ sỏi cao nhất là 71,4% sử dụng EG 0,75% [43]. Vậy nên, chúng tôi lựa chọn nồng độ EG 0,75%.
Về động vật thí nghiệm:
Trong nghiên cứu triển khai, tác giả sử dụng cả chuột cống trắng giống đực và giống cái. Điều này có ảnh hƣởng đến tỷ lệ chuột có sỏi. Các nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ chuột có sỏi ở giống đực cao hơn so với giống cái [40]. Tức là, việc gây sỏi tiết niệu bằng EG phụ thuộc vào giống đực/cái. Khi chỉ sử dụng chuột cống trắng giống đực thì tỷ lệ chuột có sỏi sẽ tăng lên, do đó, nghiên cứu của chúng tôi chỉ sử dụng chuột cống trắng giống đực để gây sỏi.
4.1.2. Về kết quả hiệu chỉnh mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo bằng EG 0,75%
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm gây sỏi tiết niệu in vivo bằng EG 0,75%, sử dụng natri citrat làm chứng dƣơng. Chúng tôi đã theo dõi, quan sát và đánh giá mô hình trên các thông số: khối lƣợng cơ thể và thể trạng chuột, các chỉ số hóa sinh và công thức máu, thể tích nƣớc tiểu, pH nƣớc tiểu, số lƣợng và kích thƣớc tinh thể CaOx trong nƣớc tiểu và mức độ lắng đọng sỏi trong thận (mô bệnh học thận).
- Về khối lượng và thể trạng chuột
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng mô hình gây sỏi tiết niệu trên thực nghiệm bằng EG 0,75% không ảnh hƣởng đến khối lƣợng chuột cũng nhƣ thể trạng chuột. Tất cả chuột đều không ghi nhận đƣợc dấu hiệu bất thƣờng nào. Không có sự khác biệt nào độ tăng khối lƣợng cơ thể chuột giữa các lô nghiên cứu. Điều này cho thấy mô hình EG 0,75% không có ảnh hƣởng nào trên thể trạng cũng nhƣ sự phát triển của động vật thí nghiệm.
- Về các chỉ số hóa sinh và công thức máu.
Để đánh giá ảnh hƣởng của mô hình lên chức năng gan và chức năng thận của chuột, chúng tôi đã định lƣợng một số thông số công thức máu nhƣ RBC, HCT, Hb, PLT, WBC và một số thông số hóa sinh máu nhƣ nồng độ creatinin, ASAT, ALAT. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa các lô nghiên cứu. Việc sử dụng EG 0,75% qua nƣớc uống hàng ngày của chuột và việc sử dụng natri citrat 2,5g/kg chuột không làm thay đổi đáng kể các thông số này trong vòng 28 ngày thí nghiệm. Mô hình gây sỏi tiết niệu trên thực nghiệm bằng EG 0,75% đơn độc không ảnh hƣởng đến chức năng gan, chức năng thận của động vật thí nghiệm.
- Về thể tích và pH nước tiểu
Thể tích nƣớc tiểu thu đƣợc ở lô EG 0,75% không có sự khác biệt so với lô bình thƣờng. Ở các nghiên cứu khác, lại không có sự đồng nhất về sự khác biệt về thể tích nƣớc tiểu ở lô uống EG 0,75% trong 28 ngày so với lô bình thƣờng [51], [58]. Tuy nhiên, việc sử dụng natri citrat 2,5g/kg lại làm tăng thể tích nƣớc tiểu lên đáng kể so với lô EG 0,75%. Trong một nghiên cứu khác, việc sử dụng citrat làm tăng không đáng kể thể tích nƣớc tiểu hoặc thậm chí làm giảm thể tích nƣớc tiểu so với lô EG 0,75% [45], [65]. Sự
khác nhau này có thể do điều kiện lấy mẫu nƣớc tiểu phụ thuộc vào: thời gian lấy mẫu, nhiệt độ, độ ẩm của môi trƣờng thí nghiệm, điều kiện chăm sóc động vật thí nghiệm trong thời gian lấy mẫu (cứ sau mỗi 2 giờ, chúng tôi cho chuột uống nƣớc hoặc EG 0,75% với thể tích 1ml/100g)….
Trong nghiên cứu này, chúng tôi ghi nhận đƣợc pH nƣớc tiểu không có sự khác nhau giữa các lô nghiên cứu. Tuy nhiên, nghiên cứu tác dụng của Rosa canina do Tayefi- Nasrabadi và các cộng sự thực hiện, kết quả cho thấy pH lô EG + citrat cao hơn có ý nghĩa thống kê so với lô gây sỏi bằng EG [65]. Sự khác nhau này có thể là do sự khác biệt về chế độ ăn của động vật nghiên cứu.
- Về số lượng và kích thước tinh thể CaOx trong nước tiểu
Về số lƣợng tinh thể CaOx trong nƣớc tiểu, kết quả cho thấy số lƣợng tinh thể ở lô EG 0,75% cao hơn đáng kể so với lô bình thƣờng, trong khi đó, lô EG 0,75% + citrat thấp hơn đáng kể so với lô EG 0,75%. Lô 0,75% + citrat gần nhƣ không quan sát đƣợc tinh thể nào. Điều này có thể do citrat với liều 2,5g/kg đã tạo ra giới hạn bão hòa muối CaOx lớn hơn ngƣỡng nồng độ oxalat mà đƣợc tạo ra bằng EG 0,75%, do đó mà không có sự kết tinh thành các tinh thể CaOx và cũng không quan sát đƣợc sự có mặt của các tinh thể này trong nƣớc tiểu [26], [72].
- Về mức độ lắng đọng sỏi trong thận
Sau 28 ngày gây sỏi tiết niệu thực nghiệm bằng EG 0,75%, mức độ lắng đọng sỏi trong thận ở lô EG 0,75% khác biệt rõ rệt so với lô bình thƣờng. Kết quả này cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu khác trên thế giới [48], [51], [58], [66]. Mặc dù, trong một số nghiên cứu, việc sử dụng mô hình EG 0,75% đơn độc không gây đƣợc sỏi trên thực nghiệm [31], [46]. Sự khác biệt này do rất nhiều yếu tố nhƣ chế độ ăn uống, điều kiện thời tiết, tính cá thể trong quần thể nghiên cứu…. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng nhận thấy rằng: ở vùng nhú thận có sự kết tập sỏi nhiều hơn và thành các đám lớn trong khi ở vùng tủy và vùng vỏ thì sỏi kết tập lại ít hơn và rải rác. Đây cũng là bằng chứng một lần nữa cho thấy việc gây sỏi tiết niệu in vivo bằng mô hình EG đơn độc gây quá bão hòa
oxalat trong nƣớc tiểu cho quá trình hình thành sỏi thận trên chuột giống nhƣ quá trình đó ở ngƣời.
Về tác dụng của chứng dƣơng citrat, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy tác dụng ức