dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu của các dược liệu Ý dĩ, Bồ Đề, Xấu hổ và Lâm vồ.
2.4.2.1. Thiết kế thí nghiệm
Chuột cống trắng giống đực đƣợc chia ngẫu nhiên thành 6 lô:
Tất cả các lô chuột đều đƣợc gây sỏi bằng dung dịch EG 0,75% bổ sung vào nƣớc uống hàng ngày. Cho chuột ăn với chế độ ăn bình thƣờng.
Lô chứng bệnh: Hàng ngày chuột đƣợc uống nƣớc cất với thể tích 1ml/100g chuột.
Lô chứng dƣơng: Hàng ngày chuột đƣợc uống dung dịch natri citrat 25% (kl/tt) với liều 2,5g/kg chuột.
Lô Ý dĩ: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Ý dĩ với liều 2,52g/kg chuột. Lô Bồ Đề: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Bồ đề với liều 2,52g/kg chuột.
Lô Xấu hổ: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Xấu hổ với liều 2,52g/kg chuột.
Lô Lâm vồ: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Lâm vồ với liều 2,52g/kg chuột.
Chuột uống nƣớc cất và các dung dịch theo qui định vào cùng một thời điểm trong ngày trong suốt quá trình thí nghiệm.
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong 28 ngày.
Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm, thu gom nƣớc tiểu 5 giờ để xác định thể tích, pH, số lƣợng và kích thƣớc tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu. Giải phẫu thận chuột để làm mô bệnh học.
Quy trình thí nghiệm đƣợc mô tả trong hình 2.2:
2.4.2.2. Các thông số đánh giá
Thể tích nƣớc tiểu
pH nƣớc tiểu
Mô bệnh học thận
Cách lấy mẫu, xử lý và đánh giá các thông số tƣơng tự nhƣ phần 2.4.1.2.
Hình 2.2: Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng của các dƣợc liệu trên mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo
2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả đƣợc biểu diễn dƣới dạng mean SE (mean: giá trị trung bình từng lô, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Dunnett test để so sánh giá trị trung bình của các lô thử với lô chứng bệnh (với thiết kế nhiều lô) hoặc TTest để so sánh giá trị trung bình của lô chứng bệnh với lô chứng trắng.
Với các số liệu không thuộc phân phối chuẩn, kết quả đƣợc trình bày dƣới dạng trung vị và tứ phân vị. Dùng thuật toán Mann – Whitney U test để so sánh kết quả giữa lô thử với lô chứng.
Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0, sự khác biệt giữa các lô đƣợc coi là có ý nghĩa khi p < 0,05.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả phƣơng pháp gây sỏi tiết niệu in vivo trên động vật thực nghiệm
3.1.1. Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến thể trạng chuột
Sau 28 ngày thí nghiệm, không nhận thấy sự khác biệt về thể trạng chuột giữa các lô nghiên cứu. Tất cả chuột đều ăn, uống, vận động bình thƣờng. Trong suốt quá trình thí nghiệm không ghi nhận đƣợc biểu hiện bất thƣờng nào trên chuột.
3.1.2. Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến khối lượng cơ thể chuột.
Theo dõi khối lƣợng cơ thể của chuột ở các lô trong suốt quá trình thực nghiệm. Ghi lại khối lƣợng cơ thể của chuột hàng tuần.
Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.1
Hình 3.1: Khối lượng cơ thể của chuột của 3 nhóm nghiên cứu trong 28 ngày thí nghiệm 100 120 140 160 180 200 220 240 260
Tuần 0 Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4
K h ối l ƣợ n g c ơ thể c h u ột ( gam ) Bình thƣờng (n=8) EG 0,75% (n=9) EG 0,75% + citrat (n=9)
Nhận xét: Khối lƣợng cơ thể chuột ở các lô nghiên cứu có xu hƣớng tăng trong tuần 1, 2 và 3, sau đó ít thay đổi ở tuần thứ 4.
Độ tăng khối lƣợng tại mỗi tuần giữa các lô nghiên cứu không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
3.1.3. Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến một số chỉ số huyết học của động vật thí nghiệm
Nghiên cứu ảnh hƣởng của mô hình gây sỏi thận bằng ethylen glycol 0,75% lên các chỉ số huyết học của động vật thực nghiệm bao gồm: số lƣợng hồng cầu (RBC), nồng độ hemoglobin (HGB), tỷ lệ hematocrit (HCT), số lƣợng tiểu cầu (PLT), số lƣợng bạch cầu (WBC) tại thời điểm kết thúc thí nghiệm.
Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Một số chỉ số huyết học của động vật thực nghiệm của 3 nhóm nghiên cứu trong 4 tuần thí nghiệm
Bình thƣờng EG 0,75% EG 0,75% + citrat n = 8 n = 9 n = 9 RBC(1013/L) 6,62 ± 0,37 7,08 ± 0,48 7,05 ± 0,25 WBC(109/L) 8,1 ± 0,5 9,1 ± 0,9 8,2 ± 0,6 PLT (109/L) 492,80 ± 37,56 575,75 ± 38,20 495,62 ± 26,60 HGB (g/dL) 0,34 ± 0,02 0,38 ± 0,03 0,36 ± 0,01 HCT (%) 89,2 ± 5,8 98,0 ± 6,3 95,5 ± 3,4
Nhận xét: Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về các chỉ số huyết học (RBC, WBC, PLT, HGB, HCT) giữa các lô nghiên cứu (p > 0,05).
3.1.4. Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến một số chỉ số hóa sinh máu của động vật thực nghiệm
Nghiên cứu ảnh hƣởng của mô hình gây sỏi thận bằng EG 0,75% lên chức năng gan, chức năng thận của chuột thí nghiệm thông qua các chỉ số nồng độ các enzym ASAT, ALAT và nồng độ creatinin (Cr) trong huyết thanh tại thời điểm kết thúc thí nghiệm.
Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2: Một số chỉ số hóa sinh của động vật thực nghiệm của 3 nhóm nghiên cứu trong 4 tuần thí nghiệm
Bình thƣờng EG 0,75% EG 0,75% + citrat
n = 8 n = 9 n = 9
ASAT (U/L) 93,33 ± 14,40 82,62 ± 5,01 98,25 ± 10,60
ALAT (U/L) 44,83 ± 4,60 44,62 ± 2,50 45,50 ± 4,20
Creatinin (µmol/L) 118,0 ± 28,0 102,0 ± 11,0 152,0 ± 41,1
Nhận xét: Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về các chỉ số hóa sinh (ASAT, ALAT, Cr) giữa các lô nghiên cứu (p > 0,05).
3.1.5. Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến thể tích nước tiểu
Xác định thể tích nƣớc tiểu 5 giờ của từng lô. So sánh thể tích nƣớc tiểu 5 giờ của các lô nghiên cứu để thấy ảnh hƣởng của mô hình nghiên cứu đến thể tích nƣớc tiểu của chuột thí nghiệm.
Kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.2.
Nhận xét: Thể tích nƣớc tiểu ở lô dùng EG 0,75% + natri citrat cao hơn có ý nghĩa thống kê so với lô dùng EG 0,75%.
Không có sự khác biệt về thể tích nƣớc tiểu giữa lô dùng EG 0,75% và lô bình thƣờng (p > 0,05).
Hình 3.2: Ảnh hưởng của mô hình nghiên cứu đến thể tích nước tiểu
bb
p < 0,01 khi so sánh với lô EG 0,75%
3.1.6. Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi thận in vivo đến pH nước tiểu
Sau khi xác định thể tích nƣớc tiểu 5 giờ của chuột, tiến hành đo pH nƣớc tiểu chuột của từng lô.
Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3
Hình 3.3: Ảnh hưởng của mô hình nghiên cứu đến pH nước tiểu chuột
3.07 3.11 8.31bb 0 2 4 6 8 10 12 Bình thƣờng (n=8) EG 0,75%(n=9) EG 0,75% + citrat (n=9) Th ể t íc h n ƣớ c t iể u 5 giờ ( m l) 8,46 8,23 8,75 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Bình thƣờng (n=8) EG 0,75% (n=9) EG 0,75% + citrat (n=9) p H n ƣớc tiểu
Nhận xét: pH nƣớc tiểu giữa các lô nghiên cứu không có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
3.1.7. Tinh thể calci oxalat trong nước tiểu khi sử dụng mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo
Về số lượng tinh thể niệu:
Quan sát tinh thể niệu dƣới kính hiển vi quang học và đánh giá theo thang điểm, kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Điểm đánh giá về số lượng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu
Lô n Điểm phản ánh tinh thể calci oxalat
(tứ phân vị)
Bình thƣờng 8 0 (0 – 0)
Lô EG 0,75% 9 3 (3 – 3)aa
Lô EG 0,75% + citrat 9 0 (0 – 0)bb
aa
p < 0,01 khi so sánh với lô bình thƣờng bb p < 0,01 khi so sánh với lô EG 0,75%
Nhận xét: Số lƣợng tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu ở lô EG 0,75% cao hơn có ý nghĩa thống kê so với lô bình thƣờng.
Ở lô EG 0,75% + citrat, số lƣợng tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô EG 0,75%.
Về hình ảnh tinh thể niệu:
Hình ảnh tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu đƣợc thể hiện trong hình 3.4 dƣới đây.
Nhận xét: Tinh thể calci oxalat chỉ đƣợc quan sát thấy ở lô EG 0,75%, gồm chủ yếu là tinh thể COM. Trong khi đó, không có mặt tinh thể calci oxalat ở các lô bình thƣờng và lô EG 0,75% + citrat. Ở lô bình thƣờng, chỉ quan sát thấy những tinh thể struvit.
Lô bình thƣờng
Lô EG 0,75%
Lô EG 0,75% + citrat
Hình 3.4: Hình ảnh tinh thể calci oxalat trong nước tiểu ở độ phóng đại x400
COM Struvit
Struvit
COM
3.1.8. Sự lắng đọng tinh thể trong thận khi sử dụng mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo bằng ethylen glycol 0,75%. in vivo bằng ethylen glycol 0,75%.
Về số lượng ống thận lắng đọng tinh thể calci oxalat:
Soi tiêu bản thận dƣới kính hiển vi quang học phân cực để xác định số lƣợng ống thận xuất hiện lắng đọng các tinh thể. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.4:
Bảng 3.4: Điểm đánh giá về số lượng ống thận có kết tập sỏi
Lô
n Điểm phản ánh mức độ lắng đọng tinh thể calci oxalat tại thận
Bình thƣờng 8 0,0 (0,0 – 0,0)
Lô EG 0,75% 9 10,0 (3,5 – 10,0)aa
Lô EG 0,75% + citrat 9 0,1 (0 – 0,1)bb
aa p < 0,01 khi so sánh với lô bình thƣờng bb p < 0,01 khi so sánh với lô EG 0,75%
Nhận xét: Sự kết tập tinh thể calci oxalat tại thận ở lô gây sỏi bằng EG 0,75% cao hơn có ý nghĩa thống kê so với lô bình thƣờng.
Ở lô sử dụng EG 0,75% + citrat, sự lắng đọng sỏi tại thận thấp hơn lô gây sỏi bằng EG 0,75% có ý nghĩa thống kê.
Về hình ảnh mô bệnh học thận dưới kính hiển vi quang học phân cực:
Hình ảnh vi thể thận của các chuột đại diện cho từng lô đƣợc trình bày trong các hình 3.5, 3.6
Nhận xét: Trên hình ảnh vi thể thận cho thấy, ở lô bình thƣờng, vi thể thận bình thƣờng, không thấy có tinh thể calci oxalat lắng đọng trong các ống thận. Trong khi đó, ở lô EG 0,75%, tinh thể calci oxalat lắng đọng rất nhiều, tụ lại thành các đám lớn, nằm ở nhiều vị trí khác nhau và rải rác trong thận từ vùng vỏ thận đến vùng nhú thận. Ở lô EG 0,75% + citrat hầu nhƣ không có sự lắng đọng tinh thể calci oxalat ở các ống thận. Trong một vài tiêu bản, chỉ có 1 hoặc 2 ống thận có sự lắng đọng tinh thể calci oxalat thành đám nhỏ.
A B C Hình 3.5: Hình ảnh vi thể thận chuột ở độ phóng đại x100 A B C Hình 3.6: Hình ảnh vi thể thận chuột ở độ phóng đại x400
A: Hình ảnh vi thể thận chuột lô bình thƣờng B: Hình ảnh vi thể thận chuột lô EG 0,75% C: Hình ảnh vi thể thận chuột lô EG 0,75% + citrat
3.2. Kết quả của phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế tạo sỏi của các dƣợc liệu Ý dĩ, Bồ Đề, Xấu hổ và Lâm vồ liệu Ý dĩ, Bồ Đề, Xấu hổ và Lâm vồ
3.2.1. Ảnh hưởng của các dược liệu đến thể tích nước tiểu
Xác định thể tích nƣớc tiểu 5 giờ của từng lô. So sánh thể tích nƣớc tiểu 5 giờ của các lô uống chế phẩm thử với lô chứng bệnh và lô chứng dƣơng để đánh giá ảnh hƣởng của từng dƣợc liệu đến thể tích nƣớc tiểu chuột thí nghiệm.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của các dược liệu đến thể tích nước tiểu (ml)
Lô Liều (g/kg) n Thể tích nƣớc tiểu (ml)
Chứng bệnh - 8 3,3 ± 0,4 Chứng dƣơng 2,5 9 8,4 ± 0,4** Ý dĩ 2,52 8 3,2 ± 0,5## Bồ đề 2,52 9 2,5 ± 0,4## Xấu hổ 2,52 9 3,9 ± 0,3## Lâm vồ 2,52 9 2,9 ± 0,4## ** p < 0,01 so với chứng bệnh ## p < 0,01 so với lô chứng dƣơng
Nhận xét: Khi so sánh với lô chứng bệnh, thể tích nƣớc tiểu ở lô chứng dƣơng cao hơn có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó, thể tích nƣớc tiểu ở các lô uống cao lỏng Ý dĩ, Bồ đề, Xấu hổ và Lâm vồ không có sự khác biệt so với ô chứng bệnh.
3.2.2. Ảnh hưởng của các dược liệu đến pH nước tiểu
Sau khi xác định thể tích nƣớc tiểu 5 giờ của chuột, tiến hành đo pH nƣớc tiểu chuột của từng lô.
Hình 3.7: Ảnh hưởng của từng loại dược liệu đến pH nước tiểu chuột Nhận xét: pH nƣớc tiểu ở các lô thuốc thử và lô chứng dƣơng không có sự khác biệt đáng kể so với lô chứng bệnh (p > 0,05).
3.2.3. Ảnh hưởng của các dược liệu đến số lượng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu
Quan sát tinh thể niệu dƣới kính hiển vi quang học, đánh giá số lƣợng và kích thƣớc các tinh thể CaOx (bao gồm các tinh thể COM và COD).
Về số lượng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu:
Sau khi đếm số lƣợng tinh thể CaOx bằng kính hiển vi quang học ở độ phóng đại x400 và cho điểm theo bảng 2.1.
Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.6:
6,94 7,12 7,07 7,45 7,07 7,51 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Chứng bệnh (n=8) Chứng dƣơng (n=9) Ý dĩ (n=8) Bồ đề (n=9) Xấu hổ (n=9) Lâm vồ (n=9) pH nƣ ớc t iểu
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của các dƣợc liệu đến số lƣợng tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu
Lô Liều (g/kg) n Điểm đánh giá số lƣợng tinh thể niệu (tứ phân vị) Chứng bệnh - 8 3 (3 – 3) Chứng dƣơng 2,5 9 0 (0 – 0)** Ý dĩ 2,52 8 3 (2 – 3)## Bồ đề 2,52 9 3 (3 – 3) ## Xấu hổ 2,52 9 3 (3 – 3) ## Lâm vồ 2,52 9 3 (3 – 3) ## ** p < 0,01 khi so sánh với chứng bệnh ##
p < 0,01 khi so với lô chứng dƣơng
Nhận xét: Số lƣợng tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu ở lô chứng dƣơng thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh. Ở các lô thuốc thử thì không có sự khác biệt về số lƣợng tinh thể CaOx trong nƣớc tiểu so với lô chứng bệnh.
Về hình ảnh tinh thể niệu:
Hình ảnh tinh thể calci oxalat của các lô đƣợc trình bày trong các hình 3.8.
Nhận xét: Hình ảnh tinh thể niệu cho thấy, tinh thể calci oxalat có mặt ở cả các lô chứng bệnh, Ý dĩ, Bồ đề, Xấu hổ và Lâm vồ. Ở lô chứng bệnh, các tinh thể có kích thƣớc lớn, số lƣợng tinh thể COM nhiều hơn số lƣợng tinh thể COD. Trong khi đó, khi quan sát lô chứng dƣơng thấy số lƣợng tinh thể calci oxalat là rất ít, kích thƣớc rất nhỏ và chủ yếu tồn lại ở dạng COD, tỷ lệ COD/COM có xu hƣớng tăng lên. Tỷ lệ này cũng có xu hƣớng tăng lên ở lô Ý dĩ và lô Bồ đề. Ở 2 dƣợc liệu Xấu hổ và Lâm vồ, kích thƣớc các tinh thể lớn, tỷ lệ COD/COM có xu hƣớng giảm xuống hoặc giữ nguyên.
Chứng bệnh Chứng dƣơng Ý dĩ
Bồ đề Xấu hổ Lâm vồ
Hình 3.8: Hình ảnh tinh thể calci oxalat trong nước tiểu của 6 lô chuột ở độ phóng đại x400
A: Lô chứng bệnh D: Lô Bồ đề
B: Lô chứng dƣơng E: Lô Xấu hổ
C: Lô Ý dĩ F: Lô Lâm vồ
COM COD COD COM COM COM COM COD COD COD COD COM
3.2.4. Tác dụng ức chế sự lắng đọng tinh thể calci oxalat trong thận trên mô hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol 0,75% hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol 0,75%
Về số lượng ống thận lắng đọng tinh thể calci oxalat:
Sau khi xác định số lƣợng ống thận xuất hiện lắng đọng các tinh thể. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.7:
Bảng 3.7: Điểm phản ánh mức độ kết tập sỏi tại thận
Lô Liều (g/kg) n Điểm phản ánh mức độ lắng đọng tinh thể calci oxalat tại thận
Chứng bệnh - 8 8,0 (2,2 – 9,6) Chứng dƣơng 2,5 9 0,4 (0,2 – 0,7)* Ý dĩ 2,52 8 0,2 (0,0 – 1,0) Bồ đề 2,52 9 4,0 (0,0 – 10,0) # Xấu hổ 2,52 9 2,8 (1,0 – 10,0)# Lâm vồ 2,52 9 5,5 (1,0 – 9,9) # * p < 0,05 khi so sánh với chứng bệnh #
p < 0,05 so với lô chứng dƣơng
Nhận xét: Số lƣợng ống thận có kết tập sỏi ở lô chứng dƣơng thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh.
Số lƣợng ống thận có kết tập sỏi ở lô Ý dĩ thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh và không có sự khác biệt đáng kể khi so với lô chứng dƣơng.