Động vật thí nghiệm

Chuột cống trắng sáu tuần tuổi, giống đực, cân nặng khoảng 110 ± 20 gam, do Học viện quân y cung cấp.

Động vật đƣợc nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm đến cân nặng khoảng 140 ± 20 gam trƣớc khi thực hiện nghiên cứu, động vật đƣợc cho ăn bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ƣơng cung cấp, uống nƣớc tự do.

2.2.2. Hóa chất thuốc thử

- Ethylen glycol ( ), 1,111 – 1,115g/ml (Xilong chemical). - Natri citrat (C6H5Na3O7), 99,9 - 100,1 % (Merck).

- Các dung môi, hóa chất và thuốc thử khác đạt tiêu chuẩn phân tích.

2.2.3. Thiết bị và dụng cụ

- Máy cất nƣớc 2 lần Hamillton của hãng Hamillton Laboratory Glas Limited. - Kính hiển vi kết nối máy ảnh của hãng Laica.

- Máy đo PH Euteck instrument pH 510 - Máy li tâm HERMLE Z300.

- Máy cất quay Buchi Rotavapor R210.

- Tủ sấy chân không Heraeus-instrument vacutherm-Kelvitront. - Cân kĩ thuật Precisa-BJ610C, TE 412 (Sartorius).

- Cân phân tích AY220 (Shimadzu). - Dụng cụ hứng nƣớc tiểu.

- Các dụng cụ khác sử dụng trong quá trình lấy mẫu và xét nghiệm nhƣ : micropipet, ống nghiệm, đầu côn các loại…

2.3. Nội dung nghiên cứu

- Hiệu chỉnh mô hình gây sỏi tiết niệu thực nghiệm bằng ethylen glycol. - Đánh giá tác dụng của các dƣợc liệu Ý dĩ, Bồ đề, Xấu Hổ và Lâm vồ trên mô hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol đã hiệu chỉnh.

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Gây sỏi tiết niệu in vivo trên thực nghiệm và đánh giá tác dụng của chứng dương natri citrat dương natri citrat

Hiệu chỉnh mô hình gây sỏi tiết niệu thực nghiệm bằng EG đã đƣợc thực hiện bởi tác giả Phạm Đức Vịnh:

- Về tác nhân gây sỏi: sử dụng EG đơn độc thay cho EG kết hợp với AC. - Về nồng độ chất gây sỏi: sử dụng EG 0,75%, đây là nồng độ thấp hơn so với nồng độ EG đƣợc sử trong nghiên cứu triển khai là 1%.

- Về động vật thí nghiệm: chỉ sử dụng chuột cống trắng giống đực, không sử dụng chuột cống trắng giống cái.

- Về thời gian gây sỏi: 4 tuần, điều này không có thay đổi so với nghiên cứu triển khai trƣớc đó.

2.4.1.1. Thiết kế thí nghiệm

Chuột đực cống trắng đƣợc chia ngẫu nhiên thành 3 lô:

Lô bình thƣờng: cho chuột ăn, uống chế độ bình thƣờng. Thƣờng ngày cho chuột uống nƣớc cất 1ml/100g chuột.

Lô EG 0,75%: cho chuột uống dung dịch EG 0,75% thay cho nƣớc uống hàng ngày. Thƣờng ngày cho chuột uống nƣớc cất 1ml/100g chuột.

Lô EG 0,75% + citrat: tƣơng tự nhƣ lô 2, tuy nhiên thay nƣớc cất bằng dung dịch natri citrat 25% (kl/tt) với liều 2,5g/kg chuột, thể tích natri citrat uống là 1ml/100g chuột.

Chuột uống nƣớc cất và natri citrat vào cùng một thời điểm trong ngày trong suốt quá trình thí nghiệm.

Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong 28 ngày.

Kết thúc thí nghiệm, thu nƣớc tiểu 5h, lấy máu làm xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu, giải phẫu thận làm mô bệnh học.

Quy trình nghiên cứu đƣợc mô tả ở hình 2.1:

2.4.1.2. Các thông số đánh giá

 Khối lƣợng cơ thể và thể trạng chuột

Tất cả chuột đƣợc theo dõi khối lƣợng vào thời điểm trƣớc ngày bắt đầu thí nghiệm và hàng tuần sau khi thí nghiệm bắt đầu.

Thể trạng của chuột (bao gồm lƣợng thức ăn, lƣợng nƣớc tiêu thụ, hoạt động của chuột, các dấu hiệu bất thƣờng trên chuột) cũng đƣợc theo dõi chặt chẽ trong thời gian nghiên cứu.

 Các thông số huyết học

Lấy máu chuột từ xoang hốc mắt bằng ống mao quản vào ống nghiệm chứa chất chống đông. Xác định các thông số: số lƣợng hồng cầu (RBC), nồng độ hemoglobin (HGB), tỷ lệ hematocrit (HCT), số lƣợng tiểu cầu (PLT), số lƣợng bạch cầu (WBC) tại bệnh viện Bạch Mai.

 Các thông số hóa sinh máu

Lấy máu từ xoang hốc mắt của chuột bằng ống mao quản vào ống nghiệm không chứa chất chống đông. Để lắng tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ. Sau đó, ly tâm ở tốc độ 3000vòng/phút trong 15 phút để lấy huyết thanh. Xác định các thông số nồng độ creatinin (Cr), ALAT, ASAT huyết thanh tại bệnh viện Bạch Mai.

 Thể tích nƣớc tiểu

Nƣớc tiểu 5 giờ đƣợc lấy vào ngày trƣớc ngày kết thúc thí nghiệm thông qua lồng hứng nƣớc tiểu. Rút thức ăn trong quá trình lấy mẫu. Vào thời điểm ban đầu, cho chuột uống nƣớc hoặc thuốc đối chiếu natri citrat đã đƣợc quy định theo lô. Sau đó, cứ mỗi 2h cho chuột uống loại nƣớc tƣơng ứng với từng lô (nƣớc hoặc EG 0,75%) với thể tích 1ml/100g chuột. Nƣớc tiểu ngay sau đó đƣợc xác định thể tích bằng ống đong.

 pH nƣớc tiểu

pH nƣớc tiểu của từng chuột đƣợc xác định ngay sau khi thi gom nƣớc tiểu.

Ngay sau khi thu gom, lấy 2ml nƣớc tiểu đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ 1,7ml dung dịch phía trên. Phần còn lại đƣợc làm đồng đều, sau đó đƣa lên phiến kính và soi bằng kính hiển vi quang học dƣới ánh sáng thƣờng ở độ phóng đại x100 và x400. Quan sát kích thƣớc và mật độ của tinh thể calci oxalat (bao gồm tinh thể COM và COD) trong nƣớc tiểu trên 5 vi trƣờng độc lập. Xác định số lƣợng tinh thể calci oxalat trung bình và cho điểm theo thang (bảng 2.1)

Bảng 2.1: Thang điểm phản ánh số lƣợng tinh thể CaOx trung bình Số lƣợng tinh thể calci oxalat trung bình Điểm

0 ≤ số tinh thể < 1 0

1 ≤ số tinh thể < 4 1

4 ≤ số tinh thể < 7 2

7 tinh thể 3

 Mô bệnh học thận

Vào ngày kết thúc thí nghiệm, tất cả chuột đƣợc giết bằng ether mê. Giải phẫu lấy hai thận. Thận trái đƣợc bảo quản bằng dung dịch formol 10%. Tiêu bản thận đƣợc cắt tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trƣờng Đại học Y Hà Nội (mỗi thận làm một tiêu bản, thận cắt dọc với lát cắt 5-7µm). Đọc tiêu bản bằng kính hiển vi quang học dƣới ánh sáng phân cực ở độ phóng đại x100 và x400 tại bộ môn Dƣợc liệu, trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội. Trên một lát cắt thận, đếm số lƣợng ống thận có sỏi CaOx trên 5 vi trƣờng khác nhau, mỗi thận đánh giá trên 10 vi trƣờng độc lập (điểm tối đa trên mỗi thận là 10).

2.4.2. Áp dụng mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đã hiệu chỉnh để đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu của các dược liệu Ý dĩ, Bồ Đề, Xấu hổ và dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu của các dược liệu Ý dĩ, Bồ Đề, Xấu hổ và Lâm vồ.

2.4.2.1. Thiết kế thí nghiệm

Chuột cống trắng giống đực đƣợc chia ngẫu nhiên thành 6 lô:

Tất cả các lô chuột đều đƣợc gây sỏi bằng dung dịch EG 0,75% bổ sung vào nƣớc uống hàng ngày. Cho chuột ăn với chế độ ăn bình thƣờng.

Lô chứng bệnh: Hàng ngày chuột đƣợc uống nƣớc cất với thể tích 1ml/100g chuột.

Lô chứng dƣơng: Hàng ngày chuột đƣợc uống dung dịch natri citrat 25% (kl/tt) với liều 2,5g/kg chuột.

Lô Ý dĩ: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Ý dĩ với liều 2,52g/kg chuột. Lô Bồ Đề: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Bồ đề với liều 2,52g/kg chuột.

Lô Xấu hổ: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Xấu hổ với liều 2,52g/kg chuột.

Lô Lâm vồ: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Lâm vồ với liều 2,52g/kg chuột.

Chuột uống nƣớc cất và các dung dịch theo qui định vào cùng một thời điểm trong ngày trong suốt quá trình thí nghiệm.

Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong 28 ngày.

Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm, thu gom nƣớc tiểu 5 giờ để xác định thể tích, pH, số lƣợng và kích thƣớc tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu. Giải phẫu thận chuột để làm mô bệnh học.

Quy trình thí nghiệm đƣợc mô tả trong hình 2.2:

2.4.2.2. Các thông số đánh giá

 Thể tích nƣớc tiểu

 pH nƣớc tiểu

 Mô bệnh học thận

Cách lấy mẫu, xử lý và đánh giá các thông số tƣơng tự nhƣ phần 2.4.1.2.

Hình 2.2: Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng của các dƣợc liệu trên mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo

2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả đƣợc biểu diễn dƣới dạng mean SE (mean: giá trị trung bình từng lô, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Dunnett test để so sánh giá trị trung bình của các lô thử với lô chứng bệnh (với thiết kế nhiều lô) hoặc TTest để so sánh giá trị trung bình của lô chứng bệnh với lô chứng trắng.

Với các số liệu không thuộc phân phối chuẩn, kết quả đƣợc trình bày dƣới dạng trung vị và tứ phân vị. Dùng thuật toán Mann – Whitney U test để so sánh kết quả giữa lô thử với lô chứng.

Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0, sự khác biệt giữa các lô đƣợc coi là có ý nghĩa khi p < 0,05.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả phƣơng pháp gây sỏi tiết niệu in vivo trên động vật thực nghiệm

3.1.1. Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến thể trạng chuột

Sau 28 ngày thí nghiệm, không nhận thấy sự khác biệt về thể trạng chuột giữa các lô nghiên cứu. Tất cả chuột đều ăn, uống, vận động bình thƣờng. Trong suốt quá trình thí nghiệm không ghi nhận đƣợc biểu hiện bất thƣờng nào trên chuột.

3.1.2. Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến khối lượng cơ thể chuột.

Theo dõi khối lƣợng cơ thể của chuột ở các lô trong suốt quá trình thực nghiệm. Ghi lại khối lƣợng cơ thể của chuột hàng tuần.

Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.1

Hình 3.1: Khối lượng cơ thể của chuột của 3 nhóm nghiên cứu trong 28 ngày thí nghiệm 100 120 140 160 180 200 220 240 260

Tuần 0 Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4

K h ối l ƣợ n g c ơ thể c h u ột ( gam ) Bình thƣờng (n=8) EG 0,75% (n=9) EG 0,75% + citrat (n=9)

Nhận xét: Khối lƣợng cơ thể chuột ở các lô nghiên cứu có xu hƣớng tăng trong tuần 1, 2 và 3, sau đó ít thay đổi ở tuần thứ 4.

Độ tăng khối lƣợng tại mỗi tuần giữa các lô nghiên cứu không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.1.3. Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến một số chỉ số huyết học của động vật thí nghiệm

Nghiên cứu ảnh hƣởng của mô hình gây sỏi thận bằng ethylen glycol 0,75% lên các chỉ số huyết học của động vật thực nghiệm bao gồm: số lƣợng hồng cầu (RBC), nồng độ hemoglobin (HGB), tỷ lệ hematocrit (HCT), số lƣợng tiểu cầu (PLT), số lƣợng bạch cầu (WBC) tại thời điểm kết thúc thí nghiệm.

Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Một số chỉ số huyết học của động vật thực nghiệm của 3 nhóm nghiên cứu trong 4 tuần thí nghiệm

Bình thƣờng EG 0,75% EG 0,75% + citrat n = 8 n = 9 n = 9 RBC(1013/L) 6,62 ± 0,37 7,08 ± 0,48 7,05 ± 0,25 WBC(109/L) 8,1 ± 0,5 9,1 ± 0,9 8,2 ± 0,6 PLT (109/L) 492,80 ± 37,56 575,75 ± 38,20 495,62 ± 26,60 HGB (g/dL) 0,34 ± 0,02 0,38 ± 0,03 0,36 ± 0,01 HCT (%) 89,2 ± 5,8 98,0 ± 6,3 95,5 ± 3,4

Nhận xét: Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về các chỉ số huyết học (RBC, WBC, PLT, HGB, HCT) giữa các lô nghiên cứu (p > 0,05).

3.1.4. Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến một số chỉ số hóa sinh máu của động vật thực nghiệm

Nghiên cứu ảnh hƣởng của mô hình gây sỏi thận bằng EG 0,75% lên chức năng gan, chức năng thận của chuột thí nghiệm thông qua các chỉ số nồng độ các enzym ASAT, ALAT và nồng độ creatinin (Cr) trong huyết thanh tại thời điểm kết thúc thí nghiệm.

Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Một số chỉ số hóa sinh của động vật thực nghiệm của 3 nhóm nghiên cứu trong 4 tuần thí nghiệm

Bình thƣờng EG 0,75% EG 0,75% + citrat

n = 8 n = 9 n = 9

ASAT (U/L) 93,33 ± 14,40 82,62 ± 5,01 98,25 ± 10,60

ALAT (U/L) 44,83 ± 4,60 44,62 ± 2,50 45,50 ± 4,20

Creatinin (µmol/L) 118,0 ± 28,0 102,0 ± 11,0 152,0 ± 41,1

Nhận xét: Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về các chỉ số hóa sinh (ASAT, ALAT, Cr) giữa các lô nghiên cứu (p > 0,05).

3.1.5. Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo đến thể tích nước tiểu

Xác định thể tích nƣớc tiểu 5 giờ của từng lô. So sánh thể tích nƣớc tiểu 5 giờ của các lô nghiên cứu để thấy ảnh hƣởng của mô hình nghiên cứu đến thể tích nƣớc tiểu của chuột thí nghiệm.

Kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.2.

Nhận xét: Thể tích nƣớc tiểu ở lô dùng EG 0,75% + natri citrat cao hơn có ý nghĩa thống kê so với lô dùng EG 0,75%.

Không có sự khác biệt về thể tích nƣớc tiểu giữa lô dùng EG 0,75% và lô bình thƣờng (p > 0,05).

Hình 3.2: Ảnh hưởng của mô hình nghiên cứu đến thể tích nước tiểu

bb

p < 0,01 khi so sánh với lô EG 0,75%

3.1.6. Ảnh hưởng của mô hình gây sỏi thận in vivo đến pH nước tiểu

Sau khi xác định thể tích nƣớc tiểu 5 giờ của chuột, tiến hành đo pH nƣớc tiểu chuột của từng lô.

Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3

Hình 3.3: Ảnh hưởng của mô hình nghiên cứu đến pH nước tiểu chuột

3.07 3.11 8.31bb 0 2 4 6 8 10 12 Bình thƣờng (n=8) EG 0,75%(n=9) EG 0,75% + citrat (n=9) Th ể t íc h n ƣớ c t iể u 5 giờ ( m l) 8,46 8,23 8,75 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Bình thƣờng (n=8) EG 0,75% (n=9) EG 0,75% + citrat (n=9) p H n ƣớc tiểu

Nhận xét: pH nƣớc tiểu giữa các lô nghiên cứu không có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.1.7. Tinh thể calci oxalat trong nước tiểu khi sử dụng mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo

Về số lượng tinh thể niệu:

Quan sát tinh thể niệu dƣới kính hiển vi quang học và đánh giá theo thang điểm, kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Điểm đánh giá về số lượng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu

Lô n Điểm phản ánh tinh thể calci oxalat

(tứ phân vị)

Bình thƣờng 8 0 (0 – 0)

Lô EG 0,75% 9 3 (3 – 3)aa

Lô EG 0,75% + citrat 9 0 (0 – 0)bb

aa

p < 0,01 khi so sánh với lô bình thƣờng bb p < 0,01 khi so sánh với lô EG 0,75%

Nhận xét: Số lƣợng tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu ở lô EG 0,75% cao hơn có ý nghĩa thống kê so với lô bình thƣờng.

Ở lô EG 0,75% + citrat, số lƣợng tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô EG 0,75%.

Về hình ảnh tinh thể niệu:

Hình ảnh tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu đƣợc thể hiện trong hình 3.4 dƣới đây.

Nhận xét: Tinh thể calci oxalat chỉ đƣợc quan sát thấy ở lô EG 0,75%, gồm chủ yếu là tinh thể COM. Trong khi đó, không có mặt tinh thể calci oxalat ở các lô bình thƣờng và lô EG 0,75% + citrat. Ở lô bình thƣờng, chỉ quan sát thấy những tinh thể struvit.

Lô bình thƣờng

Lô EG 0,75%

Lô EG 0,75% + citrat

Hình 3.4: Hình ảnh tinh thể calci oxalat trong nước tiểu ở độ phóng đại x400

COM Struvit

Struvit

COM

3.1.8. Sự lắng đọng tinh thể trong thận khi sử dụng mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo bằng ethylen glycol 0,75%. in vivo bằng ethylen glycol 0,75%.

Về số lượng ống thận lắng đọng tinh thể calci oxalat:

Soi tiêu bản thận dƣới kính hiển vi quang học phân cực để xác định số lƣợng ống thận xuất hiện lắng đọng các tinh thể. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.4:

Bảng 3.4: Điểm đánh giá về số lượng ống thận có kết tập sỏi

Lô

n Điểm phản ánh mức độ lắng đọng tinh thể calci oxalat tại thận

Bình thƣờng 8 0,0 (0,0 – 0,0)

Lô EG 0,75% 9 10,0 (3,5 – 10,0)aa

Lô EG 0,75% + citrat 9 0,1 (0 – 0,1)bb

aa p < 0,01 khi so sánh với lô bình thƣờng bb p < 0,01 khi so sánh với lô EG 0,75%

Nhận xét: Sự kết tập tinh thể calci oxalat tại thận ở lô gây sỏi bằng EG 0,75% cao hơn có ý nghĩa thống kê so với lô bình thƣờng.

Ở lô sử dụng EG 0,75% + citrat, sự lắng đọng sỏi tại thận thấp hơn lô gây sỏi