6. Đóng góp mới của đề tài
2.2.3.4.Đánh giá sự đa dạng nấm men dựa trên điều kiện nuôi cấy
Tiến hành thí nghiệm khảo sát điều kiện nuôi cấy như ảnh hưởng của các mức nhiệt độ, ảnh hưởng của độ pH tới quá trình lên men kombucha. Theo dõi quá trình lên men, phân tích các chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng CO2 thoát ra (g/1000 ml), hàm lượng cồn, cảm quan và mật độ nấm men trong dịch lên men để lựa chọn ra được môi trường nuôi lên men tốt nhất cho trà kombucha đạt chất lượng tốt nhất.
2.2.4. Phương pháp cảm quan
Sử dụng c quan cảm giác của con người để tìm hiểu mô tả và định lượng các tính chất cảm quan vốn có của thực phẩm. Cảm quan của kombucha được đánh giá trên một số chỉ tiêu theo TCVN 3215–79 [22], [47].
Bảng 2.1. Các chỉ tiêu đ nh giá mức độ cảm quan của kombucha Tên chỉ tiêu Điểm chưa có trọng lượng Yêu cầu 1 2 3 Độ trong và màu sắc
5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, mầu
hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm
4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, mầu
đặc trưng cho sản phẩm.
3 Chất lỏng trong, có tư ng đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu h i khác
một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm.
2 Chất lỏng h i đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng,
màu khác nhiều so với màu đặc trưng của sản phẩm.
1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm trọng,
thô, màu không đặc trưng cho sản phẩm.
0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng
Mùi
5 Hòa hợp, th m dịu, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, th m đặc trưng cho sản phẩm nhưng
h i khó nhận thấy.
3 H i nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trưng cho sản phẩm
2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm
1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm
0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.
Vị
5 Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm
4 hưa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trưng cho sản phẩm bình thường.
3 hưa hòa hợp, h i gắt và xốc, hậu yếu, ít đặc trưng cho sản phẩm.
2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm
1 Đắng, xốc, có vị lạ, không đặc trưng cho sản phẩm
Bảng 2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu Số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng 1 2 3 Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2,0 Tổng cộng 4,0 Bảng 2.3. Bảng quy định mức đ nh gi chất lượng sản phẩm Số thứ tự Mức chất lượng Số điểm Chung
Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chưa có trọng lượng của hội đồng cảm quan (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 Loại tốt 18,6 – 20,0 Mùi : 4,8 Vị : 4,8 2 Loại khá 15,2 – 18,5 Mùi : 3,8 Vị : 3,8 3 Loại trung Bình 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu : 2,8 4 Loại k m 7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,8
5
Loại rất
Kém 4,0 – 7,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,0 6 Loại hỏng 0 – 3,9 Mỗi chỉ tiêu nhỏ h n 1,0
2.2.5. Xử lý số liệu bằng thống kê toán học
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phư ng pháp như [18]:
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm:
1 1 n i i X X n Trong đó: X: trung bình tổng thể
Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n
n: số lần thí nghiệm
Trung bình bình phư ng các sai lệch:
1 ) ( 1 2 n X X n i i Trong đó: δ: độ lệch chuẩn
Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n
X: trung bình tổng thể
Sai số đại diện của trung bình cộng: m n Hệ số biến thiên (Cv%): Cv%= X .100%
Trong đó: Cv: hệ số biến thiên của trung bình tổng thể δ: độ lệch chuẩn
CHƯ NG 3. K T QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên Nguyên
Để phân lập các chủng nấm men có khả năng lên men kombucha cần tiến hành theo các bước sau:
Bước 1: Lên men kombucha tự nhiên
Nguyên liệu: Trà Thái Nguyên (trà đinh, trà tôm và trà đặc sản), đường sucrose. Tiến hành: Đun sôi 1000ml nước, bổ sung 20g trà để trong thời gian khoảng 10 phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh sạch, thêm 125g đường khuấy đều, để nguội. Sử dụng acid acetic điều chỉnh pH: 4,5. Sau 7 ngày ở 300
C [36] ta thu được kombucha, gồm dịch trà đường lên men và một SCOBY nổi lên trên bề mặt. Dùng vải sạch lọc lấy dịch, tiến hành phân lập nấm men.
Bước 2: Phân lập nấm men
Sử dụng môi trường Hanxen thanh trùng theo phư ng pháp Pasteur sau đó được phân vào các đĩa petri đã vô trùng.
Dịch kombucha được pha loãng từ 10-1 – 10-10, dùng pipet lấy 1 ml dịch huyền phù ở các nồng độ pha loãng khác nhau, mở h đĩa petri nhỏ vào đó từ 1 – 2 giọt, dùng bàn trang vô trùng nhẹ nhàng dàn đều thể tích đó khắp bề mặt môi trường. Nuôi trong tủ ấm 280
C trong thời gian khoảng thời gian 2 - 3 ngày.
Bước 3: Kết quả phân lập
Sau khi phân lập và nuôi trong tủ ấm đem đi quan sát thu được các kết quả như sau:
Trà đặc sản phân lập được 15 mẫu (kí hiệu Từ T1 đến T15). Trà tôm phân lập được 12 mẫu (kí hiệu T16 đến T27). Trà đinh phân lập được 9 mẫu (kí hiệu T28 đến T36).
Tổng số thu được 36 mẫu, sau khi quan sát và đo kích thước khuẩn lạc chúng tôi chia số mẫu trên thành các nhóm được miêu tả dưới bảng sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.1. Đặc điểm hình th i và kích thước của nấm men trong các mẫu phân lập
Nhóm Mẫu nấm men Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Kích thước
1 T2, T5, T9, T12, T14, T19, T21, T23, T26, T27, T31, T32, T34
Tròn, màu trắng ngà, bề mặt tr n nhẵn, nhìn nghiêng lồi, không có tâm, bờ không có răng cưa.
1,5 - 2mm
2 T1, T3, T7, T11, T13, T16, T17, T18, T20, T24, T29, T30, T33, T35
Tròn, màu trắng ngà, bề mặt tr n nhẵn, nhìn nghiêng lồi, không có tâm, bờ không có răng cưa.
2 -2,5mm
3 T4, T6, T8, T10, T22, T25, T28, T36
Tròn, màu trắng ngà, bề mặt tr n nhẵn, nhìn nghiêng lồi, không có tâm, bờ không có răng cưa.
> 2,5mm
Từ kết quả thể hiện qua bảng trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn được 9 mẫu khuẩn lạc có đường kính từ > 2mm, tr n, nhẵn, bóng được kí hiệu T1, T3, T11, T17, T20, T25, T29, T30, T36, làm đối tượng nghiên cứu và tạm gọi là các chủng nấm men.
Bước 4: Quan sát hình thái tế bào học và hình thức sinh sản của nấm men. Để quan sát hình dạng tế bào và hình thức sinh sản của 9 mẫu nấm men chúng tôi tiến hành làm tiêu bản sau đó soi trên kính hiển vi Olympus CX31 với độ phóng đại 1000 lần.
Hình3.2.Ảnh chụp khuẩn lạc nấm men trên môi trường thạch đĩa
Hình 3.3. Ảnh chụp khuẩn lạc nấm men trên môi trường thạch nghiêng
Qua quan sát chúng tôi thấy tế bào nấm men của 9 chủng hầu như gần giống nhau, chúng đều có hìnhovan và sinh sản bằng hình thức nảy chồi.
Như vậy đã phân lập được 36 mẫu nấm men và dựa vào đặc điểm hình thái, kích thước tuyển chọn sơ bộ được 9 chủng.
3.2. Tuyển chọn chúng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên Thái Nguyên
Việc tuyển chọn được chủng nấm men có chất lượng tốt nhất cho quá trình lên men kombucha và chất lượng của kombucha cần phải căn cứ vào một số chỉ tiêu, chúng tôi đã lựa chọn chủng nấm men có các tiêu chí như:
Có hoạt lực lên men cao Có khả năng chịu cồn
Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm
3.2.1. Hoạt lực lên men
Hoạt lực lên men được đánh giá bằng hàm lượng CO2 sinh ra trong quá trình lên men. Sử dụng phư ng pháp cân bình trọng lượng để xác định lượng CO2 sinh ra khi kết thúc lên men. Lượng CO2 sinh ra và thoát ra ngoài môi trường càng nhiều thì trọng lượng bình lên men càng giảm, thể hiện lực lên men mạnh. ăn cứ vào kết quả nghiên cứu của một số tác giả đã đánh giá thời gian lên men cho sản phẩm tốt nhất là 7 ngày[7], [11], [37]. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm lên men sau 7 ngày và xác định hàm lượng CO2 của 9 chủng, thu được kết quả trình bày trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lượng khí CO2 giải phóng sau 7 ngày lên men của 9 chủng nấm men
Chủng nấm men Lượng CO2 (g/100ml) T1 2,83±0,2 T3 2,68 ± 0,2 T11 2,35 ± 0,2 T17 2,80±0,2 T20 2,52 ± 0,2 T25 2,60 ± 0,2 T29 2,75±0,2 T30 2,65 ± 0,2 T36 2,70 ± 0,2
Kết quả nghiên cứu cho thấy 3 chủng T1, T17 và T29 có lượng CO2 thoát ra nhiều nhất đạt 2,75 – 2,83 g/100ml, phủ kín bề mặt lên men làm môi trường lên men ít bị ô nhiễm. Tế bào nấm men phát triển nhanh làm cho vi khuẩn, nấm men dại khó xâm nhập.
3.2.2. Khả năng chịu cồn
Khả năng chịu cồn đánh giá khả năng lên men và sinh cồn của các chủng nấm men. Tiến hành nghiên cứu trong 7 ngày với 3 mức cồn là 10o, 12o, 15o chúng tôi đã thu được kết quả sau:
Bảng 3.3. Khả năng lên men ở c c nồng độ cồn kh c nhau của 9 chủng nấm men hủng nấm men Nồng độ cồn 10o 12o 15o T1 ++ ++ ++ T3 ++ ++ _ T11 + _ _ T17 ++ ++ ++ T20 + _ _ T25 ++ + _ T29 ++ ++ ++ T30 ++ + _ T36 ++ ++ +
Trong đó: ++ Lên men mạnh + Lên men yếu _ Không lên men (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Với kết quả thể hiện qua bảng trên cho thấy: ó 7 chủng nấm men có khả năng lên men mạnh ở độ cồn 10o, 5 chủng lên men mạnh ở độ cồn 12o
, đến môi trường chứa cồn 15o
thì chỉ còn lại các chủng nấm men T1, T17 và T29 có thể chịu cồn tốt và có khả năng sinh ra nhiều cồn. Môi trường trà kombucha là môi trường lên men ít cồn, sản phẩm trà thu được là một loại giải khát có độ cồn thấp do đó các chủng nấm men chịu được môi trường chứa cồn 10o
Như vậy, ba chủng T1, T17 và T29 là các chủng có khả năng chịu cồn cao nhất, sẽ đảm bảo sức sống và sức sinh sản lớn h n cả nên chúng tôi quyết định chọn các chủng này làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3. Thử nghiệm khả năng kết lắng
Khả năng kết lắng đặc biệt quan trọng trong quá trình lên men kombucha. Điều này có ảnh hưởng rất lớn tới chất lượng cảm quan của sản phẩm, khả năng kết lắng tốt sẽ làm cho dịch lên men trong, lọc sản phẩm dễ h n [15]. Chúng tôi tiến hành đo chiều cao kết lắng sau khi đã lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3 – 5 phút và để lắng 12 phút thì thu được kết quả thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.4. Khả năng kết lắng kh c nhau của 9 chủng nấm men
Chủng nấm men Chiều cao cặn men (mm)
T1 29,5 T3 26,5 T11 20 T17 29,0 T20 23,5 T25 25 T29 28,5 T30 27 T36 27,5
Qua bảng trên cho thấy, 3 chủngT1, T17 và T29 có lớp cặn men > 28mm, do đó chúng có khả năng kết lắng tốt, cho dịch lên men trong.
3.2.4. Chất lượng cảm quan của kombucha được lên men từ 9 chủng
Sau khi lên men 7 ngày chúng tôi tiến hành đánh giá chất lượng sản phẩm dựa trên các tiêu chí của phư ng pháp cảm quan đưa ra ở các bảng 2.1, 2.2, 2.3, kết quả được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.5. Chất lượng cảm quan của các chủng nấm men
Chủng Chỉ tiêu đánh giá
Độ trong, màu sắc Mùi Vị Tổng điểm
T1 3,9 5,8 9,7 19,4 T3 3,4 5,2 8,8 17,4 T11 3,5 5,7 5,1 14,3 T17 3,8 5,7 9,6 19,1 T20 2,4 4,3 8,9 15,6 T25 2,7 4,3 7,8 14,8 T29 3,6 5,8 9,6 19,0 T30 3,0 4,9 8,4 16,3 T36 3,5 5,4 9,1 18,0
Từ kết quả trên bảng 3.5, chúng tôi có những nhận xét sau: theo các tiêu chí đánh giá cảm quan thì các chủng nấm men đều cho chất lượng sản phẩm đạt loại trung bình trở lên, không có sản phẩm hỏng hay thối, tuy nhiên các chủng cho chất lượng không đồng đều. Ví dụ T11 cho sản phẩm đạt yếu tố độ trong, màu sắc, hư ng th m thì lại không đạt về vị; T20 cho vị ngon nhưng hư ng th m chưa thực sự nổi bật, độ trong, màu sắc ở mức chưa đạt. Theo đánh giá chung thì 3 chủngT1, T17 và T29 đạt điểm cảm quan cao nhất lần lượt là 19,4; 19,1 và 19,0 cho sản phẩm trà kombucha tốt h n cả.
Qua các kết quả từ phần 3.2.1; 3.2.2; 3.2.3 và 3.2.4 chúng tôi nhận thấy 3 chủng T1, T17 và T29 là các chủng có khả năng lên men khá tốt và chúng tôi giữ 3 chủng này đem chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử để xác định độ thuần chủng của tế bào nấm men đã tuyển chọn.
3.2.5. Nghiên cứu hình dạng tế bào của 3 chủng nấm menT1, T17 và T29
Chúng tôi tiến hành chụp mẫu và quan sát tế bào trên kính hiển vi điện tử quét SEM-S4800 với độ phóng đại 10.000 lần tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ư ng.
Hình 3.4. Tế bào nấm men chụp kính hiển vi điện tử quét SEM-S4800 với độ phóng đại 10.000 lần
Sau khi quan sát, nhận thấy tế bào nấm men có hình elip và ovan, dạng sợi bông, có khả năng kết lắng tốt, sinh khối nhiều, sinh trưởng tốt trên môi trường trà đặc sản Thái Nguyên. Đối chiếu với khóa phân loại của J. Lodder (1971) [34] có thể khẳng định ba chủng nấm men T1, T17, và T29 trong kombucha được lên men từ trà Thái Nguyên là nấm men Saccharomyces cerevisiae thuộc chi Saccharomyces. húng tôi đặt tên là Saccharomyces cerevisiae T1, Saccharomyces cerevisiae T17, Saccharomyces cerevisiae T29.
Qua các kết quả từ phần 3.2.1; 3.2.2; 3.2.3; 3.2.4 và 3.2.5 cho thấy 3 chủng T1, T17 và T29 là các chủng tốt có hoạt lực lên men cao, khả năng chịu cồn và kết lắng tốt, chất lượng cảm quan tốt và được xác định là thuần khiết.
Như vậy, chúng tôi quyết định chọn 3 chủngT1, T17, và T29 làm đối tượng để tiếp tục nghiên cứu động thái sinh trưởng của nấm men.
3.3. Động th i sinh trưởng của ba chủng nấm men T1, T17 và T29
Động thái sinh trưởng của một chủng nấm men phản ánh khả năng sinh trưởng và sinh sản của chúng trong thời gian nhất định. Giai đoạn nhân giống
trong qúa trình lên men kombucha chiếm một thời gian ngắn khoảng 24 – 48 h, nhưng lại rất quan trọng trong quá trình tăng nhanh số lượng của tế bào nấm men.
Để xác định động thái sinh trưởng của 3 chủng nấm men T1, T17 và T29, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường dịch thể ở 280 trong điều kiện tĩnh, số tế bào ban đầu là 3,5.106 tế bào, sau những khoảng thời gian định sẵn, dịch nuôi cấy được lấy ra để xác định số lượng tế bào. Chúng tôi sử dụng phư ng pháp đếm số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy bằng buồng đếm ở các thời điểm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng sau.
Bảng 3.6. Động thái sinh trưởng của 3 chủng nấm men T1, T17, T29
Thời gian (h) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chủng nấm men T1 Chủng nấm men T17 Chủng nấm men T29
Số lượng tế bào (x.106/ml) Số lượng tế bào (x.106/ml) Số lượng tế bào (x.106/ml) 0 3,5±0,27 3,5± 0,26 3,5± 0,24 12 35±0,22 30± 0,38 26± 0,36 24 104±0,32 93±0,25 89±0,23 36 120±0,43 114±0,44 105±0,38 48 125± 0,49 121± 0,42 118± 0,45 60 102±0,23 98± 0,22 92± 0,28 72 89±0,25 83± 0,31 74± 0,35
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn động th i sinh trưởng của 3 chủng nấm men