Các loại môi trường

6. Đóng góp mới của đề tài

2.1.3. Các loại môi trường

* Môi trường Hanxen (môi trường phân lập) Glucose: 50g Pepton: 10g

KH2PO4: 3g MgSO4.7H2O: 2g (NH4)2SO4: 2g ThạchAgar:15-20g.

* Môi trường nhân giống Glucose:50g KH2PO4:3g (NH4)2SO4:2g MgSO4.7H2O: 2g Pepton: 10g Nước:1000ml * Môi trường lên men

Dịch trà Thái Nguyên: 200ml (Tỉ lệ Nước/trà: 200ml/4g) Glucose:100g

MgSO4.7H2O:1g

(NH4)2SO4:1g KH2PO4:2g

Nước:1000ml

2.2. Phư ng ph p nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp vi sinh

2.2.1.1. hương pháp phân lập nấm men và quá trình quan sát hình thái trên tiêu bản nhuộm gram tiêu bản nhuộm gram

Phânlập

Để chọn một tập hợp tế bào nấm men ta sử dụng phư ng pháp phân lập trên hộp petri. Môi trường để tuyển chọn các khuẩn lạc nấm men là môi trường Hanxen.

Cách làm: môi trường phân lập được khử trùng và được phân bố vào các hộp vô trùng petri để nguội theo phư ng pháp Pasteur. Dịch trà được pha loãng từ 10-1 - 10-10 bằng nước cất. Dùng pipet đã vô trùng nhỏ 1 giọt huyền phù với độ pha loãng từ 10-6 - 10-9 lên bề mặt thạch rồi dùng bàn trang vô trùng dàn đều. Gói kín lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28 - 300C trong ba ngày. Sau ba ngày trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc với đặc điểm: to, tròn, lồi, màu trắng, nhẵn, bóng đặc trưng cho nấm men.

Phư ng pháp nghiên cứu đặc điểm tế bào nấm men

Nhuộm Gram là nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế nấm men dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protit đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt.

Tiến hành: Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng có khả năng lên men kombucha làm vết bôi trên lam kính nhuộm tế bào theo phư ng pháp nhuộm Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần) [6], [8].

2.2.1.2. hương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật

Phư ng ph p đếm khuẩn lạc

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa nấm men, pha loãng theo phư ng pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 300

C sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào nấm men trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức [19].

1000 1 . . 100 10  n N A Trong đó:

N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu.

A- ố CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri.

10-n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy

Phư ng ph p đếm số lượng tế bào bằng buồng đếmGoriaev

Đây là phư ng pháp đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật có trong mẫu phân tích. Pha loãng dịch huyền phú VSV đến 10-n, nhỏ một giọt dịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa buồng đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ buồng đếm cho dịch chiếm đầy khoang. Đếm số lượng tế bào theo các ô theo đường ch o hoặc theo các góc ở trung tâm buồng đếm. Thường đếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm của buồng đếm để tính số lượng tế bào trung bình của ô lớn. Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml lúc đầu [6].

N=A x 25 : V : n

Trong đó: N – số lượng tế bào trong 1ml dịch huyền phù lúc đầu A – số lượng tế bào trung bình trong 1 ô lớn

V – thể tích của 1 ô lớn

n – độ pha loãng của mẫu ( 10-n)

25 -là số ô lớn của toàn buồng đếm 2.2.1.3. Bảo quản chủng giống

ác khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 3 - 5 ngày ở tủ ấm 300 . Sau đó giữ trong tủ lạnh 40 dùng cho nghiên cứu tiếp theo. ấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [6].

2.2.1.4. Xác định hoạt lực lên men

húng tôi xác định hoạt lực lên men của các mẫu nấm men đã được phân lập và tuyển chọn thông qua xác định hàm lượng CO2 thoát ra (g/l dịch lên men) bằng phư ng pháp cân bình trọng lượng. Hàm lượng CO2 thoát ra càng nhiều thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi kết hợp với việc xác định hàm lượng cồn để xác định hiệu suất lên men.

Phư ng pháp cân bình trọng lượng: Dịch được lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trường, có cùng một lượng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h lên men đem cân trọng lượng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại [20].

2.2.1.5. Xác định khả năng kết lắng

Khả năng kết lắng của chủng nấm men được xác định bằng tốc độ lắng của sinh khối. Phư ng pháp này được tiến hành như sau: hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (có pH: 4) được đựng trong ống nghiệm có hình dạng và kích thước như nhau. Lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian 3-5 phút, để lắng 12 phút, lúc này toàn bộ khối dịch phân thành 2

lớp, tiến hành đo chiều cao lớp phía dưới (lớp kết lắng của tế bào nấm men) trong từng ống nghiệm để xác định khả năng kết lắng của tế bào nấm men [15].

2.2.2. Phư ng ph p hóa sinh

2.2.2.1. Xác định độ cồn

Độ cồn là số ml rượu etylic nguyên chất trong 100ml rượu thử, ở nhiệt độ đúng 150

C. Nếu rượu có tinh cặn ít h n 0,5g/lít độ cồn có thể đo thẳng độ rượu bằng rượu kế. Nếu rượu có tinh cặn lớn h n 0,5g/lít, phải cất lấy dung dịch cồn và đo độ cồn trên dịch cất. Độ cồn được quy định ở nhiệt độ 150C, nếu đo ở nhiệt độ khác, tra bảng quy về độ cồn ở 150C [2], [15], [17].

Dụng cụ

Bộ chưng cất rượu: bếp điện, bình cầu chưng cất rượu, ống sinh hàn bóng, bình định mức 250ml và nhiệt kế. Ống đong hình trụ thủy tinh. Rượu kế có vạch đo rượu và nhiệt độ.

Cách tiến hành

Lấy chính xác 250ml rượu cần thử, tốt nhất là ở 150C, nếu không, phải đo nhiệt độ và ghi ch p để sau này các thao tác đều làm ở cùng một nhiệt độ. Cho vào bình cầu của dụng cụ chưng cất và cất lấy ít nhất là khoảng 200ml. chú ý đừng để cho cồn bay h i ra bị mất, bằng cách cho đầu ống sinh hàn cắm vào trong 10ml nước cất và ống sinh hàn dài được làm lạnh bằng nước lạnh không quá 200 . Để cho dịch cất trở lại nhiệt độ bằng nhiệt độ của rượu lúc đầu. Cho thêm nước cất cùng ở nhiệt độ ấy vào đủ 250ml. Cho dịch cất vào một ống đong không có mỏ, đường kính to gấp 2 đường kính chỗ to nhất của rượu kế. Thả rượu kế vào, đọc độ cồn và nhiệt độ. hú ý đừng để rượu kế sát vào thành ống đong. Tra bảng để đưa độ cồn thật về độ cồn chính xác ở 150C.

2.2.2.2. Xác định pH

Nhúng điện cực thủy tinh vào dung dịch mẫu, kết quả đo pH được hiển thị trực tiếp trên màn hình của máy đo. Để đảm bảo độ chính xác của kết quả,

cần chỉnh pH của máy theo đúng giá trị của dung dịch đệm đi kèm. Hai dung dịch đệm chuẩn thường sử dụng có pH: 7 và pH: 4.

2.2.3. Phư ng ph p nghiên cứu đa dạng nấm men

2.2.3.1. Phương pháp đếm đĩa

Về mặt truyền thống đa dạng vi sinh vật được đánh giá bởi sử dụng phư ng pháp quan sát trực tiếp và đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường thạch đĩa chọn lọc. Phư ng pháp này cung cấp thông tin nhanh về thành phần vi sinh vật hoạt động, vi sinh vật dị dưỡng của quần thể. Các hạn chế của phư ng pháp đếm đĩa là sự khó khăn trong tách riêng rẽ khuẩn lạc, có hiện tượng sinh trưởng nhanh và sinh sản số lượng lớn bào tử trên môi trường thạch đĩa. ác hạn chế này có thể ảnh hưởng đến sự chính xác tính đa dạng của vi sinh vật [9].

2.2.3.2. Đánh giá sự đa dạng nấm men dựa trên khả năng sử dụng nguồn carbon

Tiến hành thí nghiệm với các loại đường khác nhau: glucose, maltose, sucrose ởmôi trường lên men, các chỉ tiêu khác vẫn giữ nguyên. Theo dõi quá trình lên men và phân tích chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng CO2 thoát ra (g/1000 ml), hàm lượng cồn, cảm quan và mật độ nấm men trong dịch lên men sau 168h, sau đó chọn ra môi trường lên men với loại đường tốt nhất để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo [13], [37].

2.2.3.3. Đánh giá sự đa dạng nấm men dựa trên khả năng sử dụng nguồn nito

Tiến hành thí nghiệm với nguồn nito khác nhau như: amoni sulfat, amonium cloride, amoni hydrocid ở môi trường lên men, các chỉ tiêu khác vẫn giữ nguyên. Theo dõi quá trình lên men và phân tích chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng CO2 thoát ra (g/1000 ml), hàm lượng cồn, cảm quan và mật độ nấm men trong dịch lên men sau 168h, sau đó chọn ra môi trường lên men có nguồn nit tốt nhất để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo [13], [21].

* Đ nh gi khả năng sử dụng nguồn magie

Nguồn magie tôi sử dụng là MgSO4.7H2O, giống như ở môi trường c bản (MT3) nhưng chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng của MgSO4.7H2Ođến quá trình lên men kombucha. Tôi tiến hành thay đổi hàm lượng MgSO4.7H2O từ 0,03 - 0,09 % [13]. Các yếu tố còn lại của môi trường giữ nguyên. Theo dõi quá trình lên men và phân tích chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng cồn và hàm lượng đường sót trong dịch lên men sau 168h. Sau đó lựa chọn môi trường có hàm lượng MgSO4.7H2O cho lên men kombucha tốt nhất và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.3.4. Đánh giá sự đa dạng nấm men dựa trên điều kiện nuôi cấy

Tiến hành thí nghiệm khảo sát điều kiện nuôi cấy như ảnh hưởng của các mức nhiệt độ, ảnh hưởng của độ pH tới quá trình lên men kombucha. Theo dõi quá trình lên men, phân tích các chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng CO2 thoát ra (g/1000 ml), hàm lượng cồn, cảm quan và mật độ nấm men trong dịch lên men để lựa chọn ra được môi trường nuôi lên men tốt nhất cho trà kombucha đạt chất lượng tốt nhất.

2.2.4. Phương pháp cảm quan

Sử dụng c quan cảm giác của con người để tìm hiểu mô tả và định lượng các tính chất cảm quan vốn có của thực phẩm. Cảm quan của kombucha được đánh giá trên một số chỉ tiêu theo TCVN 3215–79 [22], [47].

Bảng 2.1. Các chỉ tiêu đ nh giá mức độ cảm quan của kombucha Tên chỉ tiêu Điểm chưa có trọng lượng Yêu cầu 1 2 3 Độ trong và màu sắc

5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, mầu

hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm

4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, mầu

đặc trưng cho sản phẩm.

3 Chất lỏng trong, có tư ng đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu h i khác

một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm.

2 Chất lỏng h i đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng,

màu khác nhiều so với màu đặc trưng của sản phẩm.

1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm trọng,

thô, màu không đặc trưng cho sản phẩm.

0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng

Mùi

5 Hòa hợp, th m dịu, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm.

4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, th m đặc trưng cho sản phẩm nhưng

h i khó nhận thấy.

3 H i nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trưng cho sản phẩm

2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm

1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm

0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.

Vị

5 Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm

4 hưa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trưng cho sản phẩm bình thường.

3 hưa hòa hợp, h i gắt và xốc, hậu yếu, ít đặc trưng cho sản phẩm.

2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm

1 Đắng, xốc, có vị lạ, không đặc trưng cho sản phẩm

Bảng 2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu Số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng 1 2 3 Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2,0 Tổng cộng 4,0 Bảng 2.3. Bảng quy định mức đ nh gi chất lượng sản phẩm Số thứ tự Mức chất lượng Số điểm Chung

Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chưa có trọng lượng của hội đồng cảm quan

1 Loại tốt 18,6 – 20,0 Mùi : 4,8 Vị : 4,8 2 Loại khá 15,2 – 18,5 Mùi : 3,8 Vị : 3,8 3 Loại trung Bình 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu : 2,8 4 Loại k m 7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,8

5

Loại rất

Kém 4,0 – 7,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,0 6 Loại hỏng 0 – 3,9 Mỗi chỉ tiêu nhỏ h n 1,0

2.2.5. Xử lý số liệu bằng thống kê toán học

Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phư ng pháp như [18]:

Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm:

1 1 n i i X X n    Trong đó: X: trung bình tổng thể

Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n

n: số lần thí nghiệm

Trung bình bình phư ng các sai lệch:

1 ) ( 1 2      n X X n i i  Trong đó: δ: độ lệch chuẩn

Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n

X: trung bình tổng thể

Sai số đại diện của trung bình cộng: m n    Hệ số biến thiên (Cv%): Cv%= X  .100%

Trong đó: Cv: hệ số biến thiên của trung bình tổng thể δ: độ lệch chuẩn

CHƯ NG 3. K T QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên Nguyên

Để phân lập các chủng nấm men có khả năng lên men kombucha cần tiến hành theo các bước sau:

Bước 1: Lên men kombucha tự nhiên

Nguyên liệu: Trà Thái Nguyên (trà đinh, trà tôm và trà đặc sản), đường sucrose. Tiến hành: Đun sôi 1000ml nước, bổ sung 20g trà để trong thời gian khoảng 10 phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh sạch, thêm 125g đường khuấy đều, để nguội. Sử dụng acid acetic điều chỉnh pH: 4,5. Sau 7 ngày ở 300

C [36] ta thu được kombucha, gồm dịch trà đường lên men và một SCOBY nổi lên trên bề mặt. Dùng vải sạch lọc lấy dịch, tiến hành phân lập nấm men.

Bước 2: Phân lập nấm men

Sử dụng môi trường Hanxen thanh trùng theo phư ng pháp Pasteur sau đó được phân vào các đĩa petri đã vô trùng.

Dịch kombucha được pha loãng từ 10-1 – 10-10, dùng pipet lấy 1 ml dịch huyền phù ở các nồng độ pha loãng khác nhau, mở h đĩa petri nhỏ vào đó từ 1 – 2 giọt, dùng bàn trang vô trùng nhẹ nhàng dàn đều thể tích đó khắp bề mặt môi trường. Nuôi trong tủ ấm 280

C trong thời gian khoảng thời gian 2 - 3 ngày.

Bước 3: Kết quả phân lập

Sau khi phân lập và nuôi trong tủ ấm đem đi quan sát thu được các kết quả như sau:

Trà đặc sản phân lập được 15 mẫu (kí hiệu Từ T1 đến T15). Trà tôm phân lập được 12 mẫu (kí hiệu T16 đến T27). Trà đinh phân lập được 9 mẫu (kí hiệu T28 đến T36).

Tổng số thu được 36 mẫu, sau khi quan sát và đo kích thước khuẩn lạc chúng tôi chia số mẫu trên thành các nhóm được miêu tả dưới bảng sau:

Bảng 3.1. Đặc điểm hình th i và kích thước của nấm men trong các mẫu phân lập

Nhóm Mẫu nấm men Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Kích thước

1 T2, T5, T9, T12, T14, T19, T21, T23, T26, T27, T31, T32, T34

Tròn, màu trắng ngà, bề mặt tr n nhẵn, nhìn nghiêng lồi, không có tâm, bờ không có răng cưa.

1,5 - 2mm

2 T1, T3, T7, T11, T13, T16, T17, T18, T20, T24, T29, T30, T33, T35

Tròn, màu trắng ngà, bề mặt tr n nhẵn, nhìn nghiêng lồi, không có tâm, bờ không có răng cưa.